第3章菌种选育理论与技术

第3章菌种选育理论与技术本章主讲内容1.概述2.微生物发酵工业用菌种3.育种技术§3-1概述菌种选育是一门应用科学技术,其理论基础是微生物遗传学、生物化学等,而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良菌种,从而促进生产发展。一、菌种选育的目的(一)生产1.提高发酵产量2.改进菌种的性能3.产生新的发酵产物4.去除多余的组分(二)科研1.了解菌种遗传背景2.提供分子遗传学研究材料3.获得带遗传标记的菌株4.生物合成途径的研究5.生物合成机制的研究二、菌种选育的基本理论1.遗传与变异2.遗传与变异的物质基础3.基因突变的本质和遗传变异的类型4.突变的过程5.突变后的表型变化6.表型延迟§3-2微生物发酵工业用菌种一、微生物发酵工业用菌种的特点及要求微生物发酵工业用菌种因不同的发酵对其要求各异，就是同一种产品的发酵生产，其菌种的特点和要求因不同的原料和生产设备的不同也有很大差异，例如：GA的发酵：以淀粉质为原料：要求VH-,以糖蜜为原料：因为糖蜜本身含有非常丰富的VH……但是作为工业微生物发酵使用的菌种，通常有下列特点：1.具有稳定的遗传学特性这对于工业化生产是很重要的，通常工业化生产整个周期很长，在一个发周期中，菌体至少应该增殖一次，在增殖过程中，菌体应该保证原菌的遗传学特征，（尽管菌体生长的环境改变了，压力、基质、溶氧等）2.微生物生长和产物的合成对于基质没有严格的要求换言之，可以广泛的使用各种原料作为生产用的底物，某些微生物对于底物有着严格的要求，对于碳源要求单一，这对于微生物的发酵工业提出了严格的要求，增加了生产成本。3.生长条件易于满足在微生物的工业化生产过程中，某些环境条件很难实现。氧的传递和供给就是一个很难完全满足的条件，特别是对于高粘度、高浓度的发酵体系。对于微生物的生长往往存在一个“临界溶氧浓度”，低于这个溶氧浓度，氧就成了微生物生长的限制性因子，这个溶氧浓度越高，说明菌体生长条件越易满足，从另一种意义上讲，工业化的生产成本就越低。pH值:中性偏酸性，偏碱性，强烈的pH值易改变产物和底物的状态。4.对于细菌，希望具有抗Phage的能力。5.具有较高的各种酶活力，可以在一定的范围内提高生长速率和反应速度，进而可以缩短发酵周期，降低生产成本。6.对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细胞不易发生菌体自溶。对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎；对于基因工程菌，通常目的产物存在于包含体内，对于包含体，要求在细胞破碎是不易破碎，而在目的产物的分离提出时，则易破碎。二、微生物发酵工业用菌种的种类野生型从菌种的遗传学特征上可以把菌种分为：营养缺陷型从微生物分类学的角度，分为1.细菌类：短杆菌：GA,Gln,lys……枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶)α-Amylase苏云金芽孢杆菌：BT生物农药……梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等的发酵2.酵母菌啤酒酵母：酿酒酵母、辅酶类物质的发酵酒精酵母：汉逊酵母：食品工业，用于乙酸乙酯的发酵假丝酵母：scp生产，石油发酵3.霉菌黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业（UV-11,UV-48）、酶制剂工业（糖化酶）黄曲霉：酱油生产(3042)，面酱青霉菌：青霉素的生产红曲霉：红曲制造，用于南方红曲酒（女儿红）的生产；使用红色色素的生产；豆腐乳的生产等赤霉菌：赤霉素的生产，是一种植物生长激素4.放线菌：各种抗生素，链、土、庆大等§3-3育种技术目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种等方法，带有一定的盲目性，尚属于经典育种的范畴。随着微生物学、生化遗传学的发展，出现了转化、转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法。1.自然选育在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。所谓自然突变:是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。一般认为引起自然突变有两个原因：多因素低剂量的诱变效应互变异构效应菌种的自然突变往往有两种可能性:菌种衰退，生产性能下降;代谢更加旺盛，生产性能提高。2.诱变育种2.l诱变育种的基本原理诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。突变主要包括染色体畸变和基因突变二大类。（1）染色体畸变是指染色体或DNA片断的缺失、易位、逆位、重复等。（2）基因突变是指DNA分子结构中的某一部位发生变化（又称点突变）。2.2诱变剂处理过程中几个有关的问题化学诱变剂使用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂的选择出发菌株的选择2.3诱变育种的一般步骤诱变育种一般包括诱变和筛选两个部分。诱变部分成功的关键包括出发菌株的选择、诱变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法。筛选部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能力。诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到达到高产菌株。2.4杂交育种发酵工业的优良菌种的选育主要采用诱变育种方法。但是，一个菌种长期使用诱变剂处理之后，其生活能力一般要逐渐下降，例如生长周期延长，孢子量减少，代谢减慢，产量增加缓慢，诱变因素对产量基因影响的有效性降低等。因此，有必要利用杂交育种方法。杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。3.原生质体融合技术所谓原生质体融合就是把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状体（称原生质体）。两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。在再生成细胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子。4.基因工程技术育种如果将一种生物的DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。4.1基因工程育种的优点可以按照人们的需求改变物种，获得人想要的性状，比如，转基因棉花就是通过基因工程技术，讲抗虫的基因导入棉花中，获得抗虫性状的棉花转基因大豆获得高蛋白含量，这种技术可以跨越种属，原则上，只要找到相应性状的基因，就可以实行基因改造。不过目前这个技术还不成熟，还存在许多问题，不如基因导入的不确定性，转基因食品安全的问题。4.2基因工程技术育种的设计（一）提高产量1.增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数2.增加或降低调节基因的作用3.增加抗性基因（二）改善抗生素组分1.破坏分支途径的生物合成基因2.破坏次要组分的生物合成基因3.改进抗生素生产工艺本章小结1．介绍发酵工业生产中常用的微生物菌种以及对这些微生物菌种的要求。2．分离和选育发酵工业微生物菌种的方法。3．防止工业微生物性能衰退和对于退化菌株复壮的方法。4．掌握种子培养基的配制原则和应注意的问题。5．掌握高效菌种的选育本章复习思考题1．工业用微生物的要求有哪些?试举例说明微生物在工业中的应用。2．常用工业微生物的种类有哪些?每种列举出三个典型代表，并说明其主要的发酵产品。3．工业生产中使用的微生物为什么会发生衰退?菌种衰退表现在哪些方面?防止菌种衰退的措施有哪些?4．简要说明诱变育种的操作步骤。诱变育种应注意哪些问题?5．试比较诱变育种技术、原生质体融合技术、DNA重组技术三种育种方法的优缺点。6．简述种子培养基的配制原则和应注意的问题。7.什么是增殖培养？为什么要进行增殖培养？8.基因工程育种在菌种选育中有那些方面的应用?9.简述原生质体技术育种的过程。