第3讲免疫球蛋白(第4章).

[目的要求]1.掌握免疫球蛋白的基本结构、酶解片段，各类免疫球蛋白的生物学特性与功能，单克隆抗体的概念及特点。2.熟悉免疫球蛋白V区和C区的功能。3.了解多克隆抗体与单克隆抗体的制备方法。一、基本概念1、抗体（antibody，Ab）——指B细胞接受抗原刺激后增殖、分化成浆细胞所产生的糖蛋白，主要存在于血清等体液中，通过与相应抗原特异性结合，发挥体液免疫功能。这个概念主要是从生物学功能上讲抗体球蛋白主要分布在区，但抗体≠球蛋白2．免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）——具有抗体活性、或化学结构与抗体相似的球蛋白。免疫球蛋白是从化学结构上讲抗体都是Ig，而Ig不一定都是抗体免疫球蛋白(Ig)①分泌型Ig---主要存在于血液及组织液中，发挥各种免疫功能。②膜型Ig---构成了B细胞表面的抗原受体。与抗体有关的诺贝尔奖获得者Ig基因结构Tonegawa1987单克隆抗体Koler,Milstein&Jerne1984放射免疫测定Yalow1977抗体分子结构Edelman&Poter1972抗体生成、吞噬Ehrlich&Metchnikoff1908血清治疗vonBering1901二、免疫球蛋白的结构（抗体的结构）(一)基本结构（Ig单体）1、分子组成与构型四链结构。由两对相同的多肽链借链间二硫键连接形成“Y”字形结构。Ig=2×(重链+轻链)2、重链（H链）由450-550个氨基酸残基组成，分子量约50-75kD。H链：,,,,.(Ig)IgA,IgG,IgM,IgD,IgEIg的类重链的免疫原性因其恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同而异。Ig亚类就同一类Ig，据其铰链区的氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差异，又可分为不同的亚类。IgG可分为IgG1-IgG4；IgA可分为IgA1和IgA2。3、轻链(L链)①同一个Ig分子的两条轻链同型，两条重链同类。②同一类Ig分子中既有型、又有型。由214个氨基酸残基组成，分子量约25kD。据其免疫原性不同分为、两个型。(二)Ig肽链的分区1.可变区(V区)2.恒定区(C区)N端C端variableregionconstantregion3.可变区(V区)和恒定区(C区)可变区：Ig靠N段，L链的1/2，H链的1/4，这个区的氨基酸种类和排列顺序随抗体特异性不同而有所变化，称为可变区（V区）。轻链及重链的可变区简称为VL及VH。而余下区域，其氨基酸顺序相对稳定，称为恒定区（C区）骨架区（FR）——除HVR区外的其它区域，其氨基酸的组成及排列顺序相对变化不大，一般有4个FR区。高变区(hypervariableregions，HVR)——在VL及VH各有3个区域氨基酸组成和排列顺序高度可变。高变区(hypervariableregions，HVR)又称为互补决定区(complementaritydeterminingregion,CDR)。在L链、H链的V区中各有3个高变区，两条肽链的6个高变区共同构成抗原结合部位，能与相应抗原表位特异性结合，决定了抗体的特异性。HVR1(CDR1)、HVR2(CDR2)和HVR3(CDR3)表示，一般CDR3变化程度最高。恒定区(C区)C-末端1/2L+3/4(4/5)H该肽段的氨基酸序列在同一种属动物的同一类Ig中都比较恒定针对不同抗原的同一种属同一类别的Ig，其V区不同，C区相同IgG、IgA和IgD----有CHl、CH2和CH3三个结构域，IgM和IgE-----------有CHl、CH2、CH3和CH4四个结构域。针对同一抗原表位的不同类别的Ig，其V区相同，C区不同。3、铰链区VHCH1CH2CH3CH4VLCLFabHingeregionFcCOO–NH3+⊕位于重链的CH1与CH2之间，包括H链间的二硫键；⊕富含脯氨酸,极富弹性；⊕有利于Ab与Ag的结合；⊕对蛋白酶敏感。⊕IgM和IgE无铰链区。Ig分子H链、L链中大约有110个氨基酸构成的多肽链，因具有某种生物学功能成为功能区，是一种链内二硫键链接的球形结构。结构域功能虽不相同，但结构相似。*H链:VH、CH1、CH2、CH3、(CH4)*L链:VL、CL4、结构域Ig功能区的功能VH+VL一个抗原结合位点——结合抗原CH+CL种属型标志——Ig的免疫原性(IgG)CH2(IgM)CH3(IgG)CH2C1q的结合位点——结合补体结合胎盘ＦcRn——介导IgG通过胎盘(IgG)CH3结合FcR——调理作用(MC,M,B,NK)ADCC(IgE)CH2+CH3结合FcR——I型超敏反应(肥大细胞，嗜碱性粒细胞)这些结构域的二级结构是由多股多肽链折叠形成的两个反向平行的β片层—免疫球蛋白折叠。许多膜型和分泌型分子也含有该类结构，这些分子被统称为：“免疫球蛋白超家族”(三)免疫球蛋白的辅助成分1、J链(joiningchain)由浆细胞合成的一富含半胱氨酸的多肽链；主要功能：将单体Ig分子连接成为多聚体，即参与IgA二聚体和IgM五聚体的连接。2、分泌片(secretorypiece,SP)▽保护SIgA免受蛋白水解酶降解；▽介导IgA转运到粘膜表面。是SIgA分子上的一个辅助成分。由粘膜上皮细胞合成(四)Ig的酶解片段1、IgG的木瓜蛋白酶水解片段IgG2FabFc木瓜蛋白酶十fragmentofantigenbinding①中文：抗原结合片段(1)Fab②组成：一条完整的L链和一条H链N端1/2L+(VH+CH1)③功能：结合抗原抗原结合价=1（单价）crystallizablefragment①中文：可结晶片段。(2)Fc②组成：二条H链C端1/2（即CH2+CH3，包括铰链区）。③功能：无抗原活性，是Ig与效应分子（如补体）或细胞（如巨噬细胞、NK细胞等）相互作用的部位。2、IgG胃蛋白酶水解片段IgGF(ab’)2pFc胃蛋白酶十由两个Fab片段加铰链区组成，抗原结合价=2。F(ab’)2三、抗体的功能VHCH1CH2CH3CH4VLCLFabFcCOO–NH3+V区:识别并特异性结合抗原•在体内：中和外毒素和病毒；阻断病原黏附和入侵•在体外：抗原抗体结合反应可用于免疫学诊断C区1.激活补体2.结合Fc受体•调理作用(opsonization)•介导ADCC•介导I型超敏反应3.穿越胎盘(IgG)穿过黏膜(sIgA)中和作用激活补体经典途径，溶解靶细胞调理促吞噬作用FcRantibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用AbEffectorcellTargetcell具有杀伤活性的细胞(如NK细胞)通过其表面表达的Fc受体结合包被于靶细胞(细菌或肿瘤细胞)上抗体IgG的Fc段，直接杀伤靶细胞。ADCCADCC穿过胎盘和粘膜调理作用激活补体介导ADCC穿过胎盘和粘膜中和病毒和毒素四、五类免疫球蛋白的特性与作用IgGIgMIgAIgDIgEIgG(1)一般特性(2)免疫效应作用①单体Ig分子(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)③半衰期最长(20~23天)①调理作用②ADCC③激活补体(IgG1、2、3)④通过胎盘(IgG1、3、4)⑤中和作用②血清中含量最多④亲和力高IgM(1)血清IgM的结构特点(2)合成时间：是最早合成的Ig①五聚体②分子量最大③有CH4，无铰链区(3)产量低，在体内维持的时间较短，消失快①个体发育中——最早产生②抗原刺激后——最早产生IgM(4)免疫效应作用(5)意义①激活补体②发挥早期抗感染作用①人类天然ABO血型抗体为IgM②免疫学诊断(宫内感染和早期感染)(6)mIgM是单体，为B细胞抗原受体(BCR)的主要成分IgA(1)分子组成与分布(2)分泌型IgA的免疫效应作用①血清型IgA：为单体分子①黏膜局部抗感染作用②自然被动免疫作用，即婴儿从母乳中获得sIgA②分泌型IgA:为二聚体IgD血清IgD的确切功能尚未清楚膜结合型IgD(mIgD)是BCR的重要组成成分。mIgD是B细胞分化成熟的标志成熟的B细胞表面抗原受体为mIgM+mIgD未成熟的B细胞表面仅表达mIgM活化B细胞或记忆B细胞表面的mIgD逐渐消失IgE(1)合成与分布(2)特性单体①与I型超敏反应有关有CH4、无铰链区(3)意义②参与抗寄生虫感染对肥大细胞、嗜碱性粒细胞有亲嗜性血清含量最低,主要由黏膜下淋巴细胞分泌五、人工制备抗体⊕多克隆抗体(polyclonalantibody,PAb)⊕单克隆抗体(monoclonalantibody,mAb)(一)多克隆抗体(polyclonalantibody,PcAb)多克隆抗体----一般指血清抗体，是由含多种抗原表位的抗原物质，刺激、活化多个B细胞克隆所产生的针对多种不同抗原表位的不同抗体的混合。来源广泛、制备容易。特异性不高，常出现交叉反应。(二)单克隆抗体(monoclonalantibody,mAb)1、概念由一个B细胞克隆产生的抗单一抗原表位的同源抗体。2、制备单抗的总原理将有抗原特异性、但寿命较短的浆细胞与无抗原特异性但长寿，并且可无限分裂的骨髓瘤细胞融合，建立了杂交瘤细胞单克隆抗体技术。3、单克隆抗体的特点⊕特异性强⊕结构均一(类、亚类、型都相同)⊕纯度高、效价高⊕产量高，成本低（可连续生产）⊕血清交叉反应少4、单克隆抗体在医学中的应用⊕诊断各类病原体⊕肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测⊕检测淋巴细胞的表面标志⊕“生物导弹”人-鼠嵌合抗体(chimericantibody)改型抗体(reshapedhumanizedantibody)小分子抗体:Fab片段Fc片段Fv片段双特异性抗体(bispecificantibody)Ig-融合蛋白，抗体导向酶等(三)基因工程抗体(geneticengineerantibody）在DNA水平对Ig基因进行切割、拼接或修饰，导入受体细胞表达的抗体。[重点和难点]重点：*免疫球蛋白的基本结构、酶解片段；*免疫球蛋白的功能；*各类免疫球蛋白的主要特点；*单克隆抗体的概念及特性。*概念：Ig、HVR/CDR、Fab/Fc、调理作用，ADCC、McAb难点：*免疫球蛋白的结构；*单克隆抗体的概念及制备原理。[复习思考题]第1章绪论1.免疫都是有利于机体的吗？2.固有免疫和适应性免疫的特点比较。3.牛痘苗、免疫血清疗法的发明人及意义。第2章免疫器官和组织1.淋巴结中T、B细胞的定居区域。2.为什么说骨髓既是中枢免疫器官，又是周围免疫器官？3.淋巴结和脾脏的滤过作用有何区别？4.淋巴细胞归巢的含义及分子基础。5.淋巴细胞再循环的含义及意义。[复习思考题]第3章抗原1.半抗原的含义及种类举例。2.固有免疫和适应性免疫的特点比较。3.如何理解异物性？4.如果用某种抗原免疫动物，影响血清抗体产生水平的因素有哪些？5.表位的概念。T表位和B表位的特点比较。6.为什么用牛痘病毒制备的牛痘疫苗可以预防天花病毒感染？7.TD-Ag和TI-Ag的概念及比较。8.为什么使用动物免疫血清之前必需做皮试？9.什么是超抗原？有何意义？10.常见作用于人的T、B细胞丝裂原有哪些？[复习思考题]第4章免疫球蛋白1.作图并描述Ig的基本结构。2.木瓜蛋白酶和胃蛋白酶水解IgG各得到哪些片段？有何意义？3.Ig有哪些功能？什么是调理作用和ADCC？4.IgG、IgM、sIgA的结构及特点比较。5.什么是McAb？有何优缺点？6.为什么用牛痘病毒制备的牛痘疫苗可以预防天花病毒感染？7.TD-Ag和TI-Ag的概念及比较。8.为什么使用动物免疫血清之前必需做皮试？