第六章单倍体的产生

1第六章单倍体的产生1引言1.1单倍体的概念所谓单倍体，指的是具有配子染色体数的个体或细胞。一倍体：只含有一个染色体组的个体或细胞（n=x），一倍体不能进行减数分裂,所以是不育的。二倍体：含有二个染色体组的个体或细胞（2n=2x，n代表配子染色体数，2n代表合子染色体数，x代表染色体组）。三倍体：具有三个染色体组的细胞或个体。四倍体：具有四个染色体组的细胞或个体。多倍体：细胞或个体中的染色体组数多于二个。整倍体：体细胞内含有完整的染色体组的类型称为整倍体。非整倍体：如果在二倍体的基础上，增加或减少个别染色体，这种变异的细胞或个体叫非整倍体。1.2单倍体在遗传研究和植物育种中的意义（1）在单倍体细胞中染色体组减半，表现型和基因型一致，一旦发生突变，无论是显性还是隐性，在当代就可表现出来。单倍体植株中由隐性基因控制的性状,虽经染色体加倍，但由于没有显性基因的掩盖而容易显现。因此单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。在诱导频率较高时，单倍体能在植株上较充分地显现重组的配子类型，可提供新的遗传资源和选择材料。（2）在品种间杂交育种程序中，通过F1代花药培养得到单倍体植株后，经染色体加倍立即成为纯合体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要2个世代，和常规育种方法相比，显著缩短了育种年限。1.3获得单倍体植株的途径单倍体的重要意义虽然早已为人所知，然而，由于在自然界单倍体出现的频率极低，只有O.001％～0.01％，因此以前它们并未得到广泛的利用。目前，人们诱导单倍体植株主要采用整体操作技术和花药、花粉的离体培养技术。1.3.1整体操作技术①雌核发育。通过阻止授粉途径(利用预先离子辐射处理的花粉或使用不亲和花粉)，引起未受精卵细胞发育成单倍体植株。②胚珠雄核发育。由有雄核的卵细胞发育成单倍体植株。在这种发育途径中，卵细胞核在受精前发生消失或失活。③通过远缘杂交消除一个亲本的基因组。这种情况出现在属间和种间杂交中，在受精之后的发育过程中双亲之一的基因组被选择性消除。于是，形成的胚只具有一亲本的基因组，由此发育形成的植株理所当然属于单倍体。④半受精。杂交过程中，卵细胞核与萌发花粉粒产生的精核不发生融合，各自独立地进行分裂，产生嵌合的单倍体植株。⑤化学处理。一些化学试剂如氯霉素和对氟苯丙氨酸，可能诱导体细胞或组织中的染色体丢失，产生单倍体。用甲苯蓝、顺丁烯二酰肼、一氧化二氮和秋水仙素也可能产生类似的结果。⑥高低温处理。高低温处理，可以起到抑制配子融合，诱导单倍体的作用。⑦辐射效应。据报道，X射线或紫外线能诱导染色体断裂，导致亲本的染色体丢失，形成单倍体植株。1.3.2花药、花粉的离体培养技术2整体处理方法获得单倍体植株的频率低。与此相反，使用离体培养的方法成功获得的单倍体植株数量惊人。通过花药培养(花药孤雄发育)或花粉培养诱导获得的单倍体涉及34个科约247种植物，其中包括不少有重要经济价值的植物。茄科植物特别容易诱导产生单倍体，然而十字花科、禾本科、毛茛科等植物通过花药孤雄发育(此后称为雄核发育)、单个花粉粒培养也能诱导获得单倍体。目前，这项技术已成为人们获得单倍体植株的主要途径。2通过花药和花粉培养产生单倍体的理论解释花药和花粉培养都指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化，最终发育成完整植株。只不过后者是将花粉从花药中游离出来，成为分散或游离态进行培养。从组织器官角度来说，花药培养属于器官培养的范畴，而花粉培养属于细胞培养的范畴。但两者的目的都一样，就是要诱导花粉细胞发育成单倍体植株。花药(anther)是植物花的雄性器官，包括二倍性的药壁和药隔组织以及单倍性的雄性性细胞—花粉粒(pollengrain)。一个花药的每个花粉囊中都充满了花粉粒，每个花粉粒在母体植株上的最终角色都是发育成一个雄配子体。但在花药的离体培养过程中，花粉粒的命运会脱离常轨，最终发育成一个单倍体的孢子体。为什么会这样呢？这涉及到花粉小孢子的发育途径。2.1活体小孢子发育途径一个花粉母细胞经过连续2次细胞分离（第一次减数分裂，第二次有丝分裂），形成4个子细胞，称为四分体，四分体分散成单核花粉粒。在正常情况下，单核经第一次有丝分裂，产生一个大而疏松的营养核和一个小而致密的生殖核，称二核花粉粒。第二次有丝分裂仅限于生殖核，形成两个精子，它们处在花粉或花粉管中，称为三核花粉粒。最后花粉粒进一步膨大，花粉进入成熟期。2.2离体小孢子发育途径在离体培养条件下，花粉是产生花粉植株的原始细胞，我们把花粉形成植株的途径称为“花粉孢子体发育途径”。目前，多数学者习惯把小孢子或花粉沿孢子体途径发育成花粉植株的过程称为“雄核发育”。离体培养时，小孢子在培养过程中呈现不同的发育模式。目前，一般根据小孢子第一次有丝分裂的情况将雄核发育分为A途径(不均等分裂)和B途径(均等分裂)，其中A途径又根据第二次分裂及其以后的情况细分为A-V途径、A-G途径、A-VG途径(又称E途径)及C途径(图6-1)。3图5—1小孢子正常发育途径与离体培养条件下胚胎发育途径比较A．第一次有丝分裂为非均等分裂，形成一个营养核、一个生殖核A－V．营养核重复分裂而生殖核败育A－G．生殖核重复分裂而营养核败育A－VG．生殖核和营养核共同分裂C．营养核、生殖核分别或同时进行核内复制，有丝分裂后核融合分别形成二倍体、三倍体、四倍体胚B．第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个相似的营养型核，进而重复分裂形成单倍体胚或先核融合然后重复分裂形成多倍体胚D．自然条件下小孢子的第二次分裂、淀粉粒及萌发形成的花粉管2.2.1A途径小孢子的第一次有丝分裂按配子体方式进行，为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞(或营养核和生殖核)，这种途径又可细分为以下几种途径：(1)A-V途径多细胞花粉(或多核花粉)由营养细胞重复分裂衍生而成，生殖细胞以游离核的形式存在一个周期后退化，或分裂一至数次存在于多核花粉的一侧，有的甚至到球形胚形成仍存在。因此，生殖核并不参与花粉孢子体的形成，4在花粉中往往可以观察到生殖细胞的存在。(2)A-G途径生殖细胞进行多次分裂形成胚状体，营养细胞不分裂或者仅分裂数次形成胚柄结构。由生殖细胞形成的细胞群其核致密，染色后着色较深，容易同营养细胞衍生而来的细胞群区分开来。(3)A-VG途径(又称E途径)花粉内的营养细胞和生殖细胞独立分裂，形成两类细胞群，各群的子细胞都类似其母细胞。(4)C途径在获得的花粉植株群体中，除单倍体外，常有相当比例的二倍体、三倍体、四倍体、非整倍体等非单倍体植株，即出现小孢子培养过程中染色体自发加倍现象。1977年，Sunderland提出C途径，即生殖细胞和营养细胞通过核融合后共同形成多细胞花粉，产生非单倍体植株。此途径中生殖核与营养核共同参与了花粉植株的形成。2.2.2B途径小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个大小相近的细胞(或游离核)。以后，由这两个细胞(或游离核)连续分裂产生单一类细胞组成的多细胞花粉或多核花粉。2.2花粉植株形态发生方式如果不考虑小孢子核的早期分裂行为，花粉植株的形态发生有两种途径，即胚状体发育途径（直接发生途径）和愈伤组织发生途径（间接发生途径）（图6－2）。图6－2花药培养与花粉植株的形态发生方式3花药培养的一般程序3.1取材花药在接种以前，应预先用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发育时5期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗的大小、颜色等外部特征之间的对应关系。一般而言，单核后期花药对培养反应较好。但值得注意的是，这种相关性绝不是一成不变的，而会因品种和气候的不同而异，因此，在实验中还必须由每个花蕾取出一个花药，通过镜检确定花粉发育的准确时期。3.2预处理适当的预处理可以显著提高花药的愈伤组织诱导率。常用的预处理方法是低温冷藏，具体的处理温度和时间长度因物种而异：但低温预处理对小麦效果不稳定，有时还有负效果。3.3消毒花药适宜培养时，花蕾尚未开放，花药在花被或颖片的严密包被之中，本身处于无菌状态。因此，通常只要以70％酒精喷洒或擦拭花器或包被着麦穗的叶鞘表面，即可达到灭菌要求。3.4接种在无菌条件下把雄蕊上的花药轻轻地从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养，在整个操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。如果所碰到的是花器很小的植物，如天门冬属、芸苔属和三叶草属植物等，可能需要借助解剖镜夹取花药，或是只把花被去掉，把花蕾的其余部分连同其中原封未动的雄蕊一起接种在培养基上。在有些情况下，甚至是接种整个花序以得到花粉单倍体。然而这种简单化的方法只适用于这样一些基因型，即其中雄核发育在只含无机盐、维生素和糖的简单培养基上即可进行，而在这种培养基上孢子体组织增殖的机会很少。不过，当必须使用生长素才能诱导花粉粒雄核发育的时候，应当尽可能把孢子体组织去掉。由于花药对离体培养的反应存在“密度效应”，因此每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的群体密度。3.5培养方式和培养条件培养方式：花药的培养方式主要有3种：一是在琼脂固化培养基表面培养，二是在加入30％Ficoll(水溶性聚蔗糖)的液体培养基表面飘浮培养，三是利用固体一液体双层培养基培养，以便既能保持较高的接种密度，培养基又不易失水干涸。培养条件：主要包括温度和光照。（1）温度花药对培养温度的要求因物种而不同，对于大多数小麦品种来说，在培养的最初6d给以30～32℃的较高温度，然后再转入28～30℃下培养，花药出愈率会有明显提高。水稻花药培养的适宜温度从一开始就是27℃。愈伤组织分化阶段对温度的要求不像诱导阶段那样严格，例如小麦在17℃和30℃下花粉愈伤组织分化频率没有显著差异，水稻花粉植株的分化也多在和诱导期间相同的温度下进行。（2）光照对光照的要求在物种间差异更为明显。如连续光照可显著增加烟草花粉胚的产量，却强烈抑制曼陀罗的花粉胚胎发生。禾谷类植物在花粉愈伤组织诱导期间则以暗培养或散射光培养效果较好，强光会抑制小麦花粉愈伤组织的形成。愈伤组织的分化原则上都应在光照下进行，但对光照强度和照光时间的要求则因物种而异。例如水稻花粉愈伤组织在转入分化培养基之初仍不宜照光培养，须待3～5d后再给以每天14h，1000～2000lx的光照，以免引起愈伤组织6的老化坏死。对小麦花粉植株则不宜给以长日照。3.6花粉植株的诱导烟草花药接种在无激素培养基上1周以后，即有部分花粉粒开始膨大，2周以后细胞开始不断分裂，相继形成球形胚、心形胚和鱼雷形胚等，3周后在花药开裂处即可见到许多淡黄色的胚状体，见光后变绿，并逐渐长成小苗。禾本科植物的花药在培养中通常不能形成胚状体，在这类植物中，花粉植株的诱导往往要分两步进行。第一步，将花药接种在含有2,4－D(1～2mg／L)的诱导培养基上，诱导花粉粒形成单倍体愈伤组织。第二步，当花粉愈伤组织形成后10～15d，其直径已长到1.5～2.Omm时，及时把它们转到分化培养基上诱导植株分化。分化培养基中不含2,4-D，含有NAA和KT各0.5mg／L。在分化培养基上，愈伤组织表面陆续分化出芽和根。在烟草中，花粉植株是经由胚状体产生的，因此几乎都是单倍体。在稻麦等植物中，由于花粉植株是经由愈伤组织产生的，染色体数常有变化，其中既有单倍体，也有二倍体、三倍体以及各种非整倍体等。4花粉培养在花药培养中，由于一个花药内的花粉粒在遗传上是异质的，因此，由一个花药所产生的植株，将构成一个异质的群体。如果单倍体植株是经由花粉愈伤组织的途径产生的，由于从若干花粉起源的愈伤组织常常混在一起，因此由一个花药形成的愈伤组织将会是一个嵌合体。而且，如果在花粉愈伤组织化的同时，花药壁细胞也进行增殖，那么最终所得到的愈伤组织就不可能具有纯粹的配子体起源。解决这个问题的方法是培养离体小孢子或花粉粒，并诱导它们进行雄核发育。与花药培养相比较，花粉培养在某些方面具有一定的优越性。如花粉培养不存在花药中的有害物质，不影响小孢子启动第一次分裂；排除了药壁、药隔、花丝的干扰，从小孢子中获得的材料是纯合的；小孢子能均匀地接触化学和物理