第六章工业微生物产生菌的分离筛选

第六章工业微生物产生菌的分离筛选本章内容：含微生物样品的采集含微生物样品的富集培养微生物的分离野生菌株的筛选和目的产物的鉴别菌种改进发酵工艺和设备得到理想的发酵产品从自然界中分离得到，经过筛选、纯化及培养条件的研究第一株应用于发酵工业的青霉素生产菌是从美国伊利诺斯洲长霉的葡萄柚中分离出来第一株头孢霉素生产菌则来自于意大利撒丁岛的污水中。•菌种收集和筛选途径向菌种保藏机构索取有的菌株，从中筛选所需菌株。由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。第一节含微生物样品的采集一、从土壤中采样（一）根据土壤特点1.土壤有机质含量和通气状况5—25cm土层，适合微生物生长，每克土中含菌数约几十万到几十亿个。酵母菌分布土层最浅，约5—10cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。2.土壤酸碱度和植被状况偏碱土壤环境，适合于细菌、放线菌生长。偏酸的土壤环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。植物根部的分泌物有所不同，即植被对微生物分布也有一定的影响。如番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C产生菌。葡萄或其他果树在果实成熟时，其根部附近土壤中酵母菌数量增多。豆科植物的植被下，根瘤菌数量比其他植被下占优势。3.地理条件南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多，特别是热带和亚热带地区的土壤。许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多从南方土壤中筛选出来。——南方温度高，温暖季节长，雨水多，相对湿度高，植物种类多，植被覆盖面大，土壤有机质丰富，造成得天独厚的微生物生长环境。4.季节条件不同季节微生物数量有明显的变化，冬季温度低，气候干燥，微生物生长缓慢，数量最少。到了春天随着气温的升高，微生物生长旺盛，数量逐渐增加。南方，春季往往雨水多，土壤含水量高，通气不良，即使有微生物所需的温度、湿度，也不利于其生长繁殖。随后经过夏季到秋季，约有7—10个月处在较高的温度和丰富的植被下，土壤中微生物数量比任何时候都多，因此，秋季采土样最为理想。（二）采样方法用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5—25cm处的土样10—25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10—30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。如果样品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。将取好的土样混匀，取3—4g撒到试管斜面上，可避免菌株不能及时分离而死亡。二、根据微生物生理特点采样1.根据微生物营养类型每种微生物对碳、氮源的需求不一样，分布也有差异。微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。如：森林土富含纤维素——适合纤维素酶产生菌的生长；肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中——分离蛋白酶和脂肪酶产生菌；面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所——分离产生淀粉酶、糖化酶的菌株。蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高的植物汁液中——筛选酵母菌。柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有较多的果胶——分离果胶酶产生菌。2.根据微生物的生理特性在筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。如：筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火上爆发处及北方的堆肥中采样；海洋底部采样——分离耐压菌；甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样——分离耐高渗透压酵母菌。若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的结果。2.极端环境条件的影响高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下，也有少数微生物存在，这类微生物被称为极端微生物。生活所处的特殊环境，导致它们具有不同于一般微生物的遗传特性、特殊结构和生理机能，因而在冶金、采矿及生产特殊酶制剂方面有着巨大的应用价值。1.局部环境条件的影响微生物的分布除了本身的生理特性和环境条件综合因素的影响之外，还要受局部环境条件的影响。海洋对于微生物来说是一个特殊的局部环境，使海洋微生物具备特殊的生理活性，相应也产生了一些不同于陆地来源的特殊产物。具有特殊性质的微生物通常分布在一些特殊的环境中。三、特殊环境下采样第二节含微生物样品的富集培养•富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。•富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。一、控制培养基的营养成分微生物的代谢类型十分丰富，其分布状态随环境条件的不同而异。在富集培养时，还需根据微生物的不同种类选用相应的富集培养基。根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点，可通过连续富集培养的方法分离降解高浓度污染物的环保菌。二、控制培养条件在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱，霉菌和酵母菌要求偏酸。分离放线菌时，可将样品液在40℃恒温预处理20min，有利于孢子的萌发，可以较大地增加放线菌数目，达到富集的目的。三、抑制不需要的菌类在分离筛选的过程中，除了通过控制营养和培养条件，增加富集微生物的数量以利于分离外，还可通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到富集的目的。如土壤中分离芽孢杆菌，可先将土样加热到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h筛选霉菌时，可在培养集中加入四环素等抗生素抑制细菌分离放线菌时，在样品悬浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素、链霉素，以及丙酸钠抑制霉菌和细菌的生长。第三节微生物的分离一、好气微生物的分离（一）稀释涂布法（二）划线分离法（三）利用平皿的生化反应进行分离1.透明圈法在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌的分离。2.变色圈法对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。如：筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。分离谷氨酸产生菌时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，变色范围在pH6.2—7.6，当pH在6.2以下时为黄色，pH7.6以上为蓝色。通过平板上产生的变色圈还可快速分离筛选产乙醇的菌株。在以糖为碳源的琼脂平板的菌落上，覆盖一层含有盐类物质的琼脂，该蓝色物质在乙醇脱氢酶和NAD作用下（在少量乙醇存在时）反应产生的电子脱色。3.生长圈法生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。4.抑菌圈法常用于抗生素产生菌的分离筛选。抑菌圈法是常用的初筛方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。（四）组织分离法1.对一般有病组织的分离方法——是由一些有病组织或特殊组织中分离菌株的方法。如从患恶苗病的水稻组织中分离赤霉菌，从根瘤中分离根瘤菌，及从各种食用的子实体中分离孢子等。切除小块含菌组织——洗去表面污物——10%漂白粉或0.1%升汞浸泡2—5min，无菌水冲洗——移至平皿上培养——观察菌落——挑入斜面培养——分离纯化、筛选。从豆科植物的根瘤中分离根瘤菌：取根瘤——10%漂白粉或0.1%升汞浸泡2—5min，无菌水冲洗——用无菌镊子将根瘤压破，取汁液少许与分离培养基混合倒入平皿，摊平，培养——观察菌落——挑入斜面培养。2.食用菌孢子分离法（1）多孢子分离法（2）单孢子分离法（五）单细胞或单孢子分离法（六）特殊菌类——环保降解菌的分离二、通过控制营养和培养条件进行分离1.培养基的营养成分2.培养基的pH3.排除不需要的菌类4.控制培养温度三、厌气菌的分离（一）加还原剂分离培养基内加入还原剂，如半胱氨酸、D型维生素C、硫化钠等，操作时以最快的速度划线分离，然后立即置于事先已抽真空密闭的容器内（充CO2或N2也可），于适温培养。（二）焦性没食子酸法焦性没食子酸和NaOH互相反应除去氧气。要除去100mL空气中的氧气需要焦性没食子酸固体1g和10%NaOH溶液10mL。（六）生物吸氧法（五）玻璃板隔绝空气培养法（四）试管厌气培养法（三）平皿厌气培养法第四节野生菌株的筛选和目的产物的鉴别一、初筛1.平板筛选初筛是从大量分离到的微生物中将具有合成目的产物的微生物筛选出来的过程。由于菌株多，工作量大，为了提高初筛的效率，通常需要设计一种快速、简便又较为准确的筛选方法。对那些在纯化分离阶段没有采用平皿定性法挑选出来的菌落，即随机挑选的菌株，由于数量很大，又不知是否具有目的产物的生产能力，这时只能首先采取较粗放的检测方法：对那些在纯化分离阶段没有采用平皿定性法挑选出来的菌落，即随机挑选的菌株，由于数量很大，又不知是否具有目的产物的生产能力，这时只能首先采取较粗放的检测方法：如筛选产生碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌时，可以将分离得到的菌株，点种在含有0.3%—0.4%酪蛋白的琼脂平板上，适温培养后，测量形成的水解圈直径和菌落直径的比值来表示酶活力的强弱。挑选其中产酶能力强的菌株进一步用摇瓶培养、筛选。在筛选谷氨酸菌种时，用一种不含有机氮（如蛋白胨）的培养基，使分离得到的菌株在这种培养基上形成单菌落，用内径6—8mm的打孔器，把菌落连同琼脂培养基逐个取出，放在灭过菌的滤纸上，放置一定时间，菌落产生的氨基酸会渗透并扩散到滤纸上，喷上茚三酮，出现成色圈者即为氨基酸的产生菌。菌种选育工作者在初筛时经常使用这种平皿快速检测法，将复杂而费时的化学测定改为平皿上肉眼可见的显色或生化反应，能较大幅度地提高筛选效率，减少工作量。如以往在分离生物表面活性剂产生菌时，传统方法：测定菌株的排油活性、表面张力、乳化性能等，工作量大，效率低。改良法：根据生物表面活性剂能够溶血的原理，把加入羊血的培养基作成平板，将菌株逐个点种，适温培养1—2d，挑选溶血的单菌落。2.摇瓶发酵筛选由于摇瓶振荡培养法更接近于发酵罐培养的条件，效果比较一致，由此筛选到的菌株易于推广。一个菌株接一个瓶，在一定转速的摇瓶机上及适宜的温度下振荡培养，得到的发酵液过滤后进行活性测定：取玻璃板16cm×26cm或18cm×28cm，制备含有鉴定菌（测定抗生素）或底物（酶制剂）等的平板。琼脂板厚约3mm，用内径5mm钢圈打孔，取以上过滤后的发酵液10l逐个加入，放在鉴定菌或酶作用最适温度下温育一定时间，孔的周围出现透明的溶菌圈或水解圈。根据活性圈的大小决定取舍。二、复筛琼脂平板活性测定法，其最大的优点就是简便、快速，因而在筛选工作量大时具有相当的优越性。该法不足之处是产物活性只能相对比较，难以得到确切的产量水平，只适用于初筛。通过初筛可淘汰85%—90%不符合要求的微生物，剩余的较好的菌株则需进行摇瓶培养复筛。复筛过程中，要结合各种培养条件，如培养基、温度、pH、供氧量等进行筛选，也可对同一个菌株的各种培养因素加以组合，构成不同培养条件进行试验，以便初步掌握野生型菌株适合的培养条件。