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抗肿瘤药物筛选张冬梅一、导论二、整体动物水平的筛选三、细胞水平的筛选四、酶水平的筛选五、展望一、导论1.肿瘤发病率和死亡率全球每年癌症新发病例都在1200万以上，因癌症死亡人数达760多万，到2010年底全球肿瘤病人总数已逾5500万人(WHO)。2005年全球常见疾病死亡率心脏病脑血管病肿瘤25%消化系统病肺病其他中国每年新增肿瘤病人200万人，死亡130-170多万人左右，目前全国肿瘤患者总数约450万人，并以每年3%的速度递增。肿瘤已经成为中国公民的头号杀手，每年因恶性肿瘤而死亡的人口占到总死亡率的22%。2009年中国居民主要疾病死亡率及死亡原因构成死亡原因死亡率(1/10万)占总死亡人数百分率恶性肿瘤13522%脑血管病11120%心脏病9618%呼吸系统病7215%损伤和中毒315%消化系统病175%糖尿病171%(中国卫生年鉴)２００9年中国常见恶性肿瘤的死亡率我国居民常见癌症死亡率:胃癌列肿瘤死亡率首位;其次肝癌、肺癌、食管癌、结直肠癌等。2.肿瘤的治疗方法外科手术治疗放射线治疗化学药物治疗3.常用的化疗药物烷化剂环磷酰胺、异环磷酰胺抗代谢药物甲氨蝶呤、氟脲嘧啶、阿糖胞苷抗肿瘤抗生素柔红霉素、阿霉素、丝裂霉素、多柔比星铂类化合物顺铂、卡铂、奥沙利铂抗肿瘤植物药长春新碱、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇激素类血管新生抑制剂贝伐珠单抗注射液、舒尼替尼、索拉非尼化疗药物的主要不良反应骨髓抑制（血细胞减少）胃肠道反应（恶心、呕吐、食欲不振等）全身反应（脱发、发热、皮疹）对各器官影响（心脏毒性、肝脏毒性、神经毒性）泌尿道毒性（血尿、蛋白尿、尿酸性肾病）局部静脉炎致畸、致突变、致癌4.天然产物与抗肿瘤药物天然产物在新药及新药先导化合物的发现中起着不可替代的作用，是结构新颖和作用独特的抗肿瘤化合物的重要来源。美国国立癌症研究所（NCI）从1955年开始从天然产物中筛选抗肿瘤药物。目前世界上被批准广泛使用的抗肿瘤药物中,５０％以上来源于天然产物。二、整体动物水平的筛选１．非实体瘤动物模型肿瘤名称代号宿主肿瘤名称代号宿主艾氏腹水瘤ECAKM小鼠BALB/c小鼠肉瘤腹水型S180AKM小鼠BALB/c小鼠肝癌腹水瘤HepAKM小鼠BALB/c小鼠白血病L1210DBA小鼠白血病P388KM小鼠BALB/c小鼠白血病P615615小鼠常用小鼠腹水瘤动物模型表（细胞株及动物）国内外推荐模型肿瘤移植方法：1）无菌操作2）接种部位：腹腔3）癌细胞悬液的制备及接种接种7~10天小鼠处死，酒精消毒，穿过腹部肌肉吸取腹水2~4mL*，置冰块上保存。细胞计数后，PBS稀释制备1x107/0.1mL细胞浓度悬液，每只小鼠注射0.2mL肿瘤细胞悬液注射到腹腔。5天左右，小鼠出现腹水即为造模成功。*腹水应为白色浓稠液体，若为黄色或红色应弃去给药及药效评价：动物分组：随机分五组（溶剂对照组、阳性药组、高、中、低给药组）；每组8-10只。药品制备：药品溶解生理盐水或PBS等缓冲盐溶液给药方式：连续给药；1-2次/天;（ig,ip,iv）14天以上评价指标：观察记录荷瘤小鼠的存活天数（30天）（7天死亡率≥20%或20%动物存活超过4周，实验失败对照组存活时间14-20天）数据处理：生命延长率(%)＝治疗组存活天数－对照组存活天数对照组存活天数非腹腔给药生命延长率50%腹腔给药75%x100%２.实体瘤动物模型1）动物移植性肿瘤肿瘤名称代号宿主肿瘤名称代号宿主艾氏癌实体型ECSKM小鼠BALB/c小鼠肉瘤S180KM小鼠BALB/c小鼠肝癌实体型HepSKM小鼠BALB/c小鼠黑色素瘤B16C57BL/6小鼠BALB/c小鼠肺癌LewisC57BL/6小鼠BALB/c小鼠结肠癌C26BALB/c小鼠瓦克癌肉瘤W256Wistar大鼠结肠癌C38BALB/c小鼠常用小鼠、大鼠实体瘤动物模型表（细胞株及动物）国内外推荐模型肿瘤移植方法：1）无菌操作2）接种部位：右前肢腋下3）癌块的制备及接种接种7~10天小鼠处死，酒精消毒，切开皮肤取出肿瘤块，置于生理盐水中，冰块上保存。剪碎瘤块成2-3mm3的小块或组织块匀浆成细胞悬液，接种到右前肢腋下。5天左右，小鼠出现瘤块即为造模成功。7天后对照组20%小鼠肿瘤小于400mg或大于2g，实验失败给药及药效评价：给药方式：连续给药；1-2次/天;（ig,ip,iv）10-12天评价指标：记录小鼠的体重变化。12天后，处死小鼠，拨瘤称重（对照组瘤重1g左右）。取脾脏和胸腺称重，并测定脾细胞数目数据处理：抑瘤率(%)＝对照组瘤重－治疗组瘤重对照组瘤重抑瘤率30%认为有效x100%２）人癌异种移植模型细胞：人源肝癌，胃癌，肺癌，结肠癌等肿瘤细胞动物：裸鼠（nudemice）特点：1）裸体，行似无毛；2）不能执行正常T细胞功能，免疫力低下3）B细胞功能正常，NK细胞活性高T淋巴功能缺陷先天性无胸腺小鼠11号染色体上隐性突变裸基因（nu）肿瘤移植和给药方法：1）无菌操作2）接种部位：背部3）细胞悬液的制备及接种细胞悬液浓度1x108/mL，接种0.1mL到背部。7天左右，瘤块达到50mm3体积即为造模成功，开始给药。4）给药时间：根据药效确定，一般12-60天。阳性药5-Fu（5-氟尿嘧啶）ADM（阿霉素）Taxol（紫杉醇）CTX（环磷酰胺）选择性对照药推荐剂量：1-20mg/kg给药方式：与测试药物相同;常隔天给药药效评价：评价指标：记录小鼠的体重变化。结束治疗后，处死小鼠，拨瘤称重（对照组瘤重1g左右）。取脾脏称重，并测定脾细胞数目。数据处理：抑瘤率(%)＝对照组肿瘤体积－治疗组肿瘤体积对照组肿瘤体积抑瘤率30%认为有效x100%抗肿瘤谱Taxol（卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、食管癌、淋巴瘤）5-Fu（乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤）ADM（乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤和皮肤癌）沙蟾毒精的体内抗肿瘤作用(Carcinogenesis,2013,34:1331)三、细胞水平的筛选1.抑制肿瘤细胞增殖实验2.诱导肿瘤细胞分化实验3.诱导肿瘤细胞凋亡实验4.抗肿瘤血管生成实验5.肿瘤多药耐药性逆转实验6.抗肿瘤侵袭和转移实验7.诱导肿瘤细胞自噬实验细胞株的选择１.抑制肿瘤细胞增殖实验A)噻唑兰实验（MTT）原理：活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的MTT，生成蓝紫色不溶于水的甲臜（Formazan）。甲臜的多少可以用酶标仪在570nm处进行测定。甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。MTT原理示意图甲臜生成量正比于活细胞数采用比色法（570nm）测定甲臜生成量实验方法1）细胞培养培养液：RPMI1640、DMEM、MEM、M199、McCoy’s5A等血清：FBS、NBS、抗生素：青霉素、链霉素、庆大霉素、新生霉素等胰酶：Trypsin-EDTA、Collagenase缓冲液：PBS、HBSS等生长因子：EGF、B-27、N-2等2）细胞传代贴壁细胞生长3-5天，80%融合度。用胰酶消化1-3min后，离心，调节适当密度重新悬浮在培养液中。3）细胞计数细胞计数板5）细胞接种3000-10000细胞接种在96孔板，贴壁24小时，或对数生长期6）加药处理72h（指定时间点）7）MTT溶液（5mg/ml），孵育2-4小时8）弃去培养液，加入DMSO溶解生成的甲臜9）酶标仪测定OD值结果处理：肿瘤细胞生长抑制率（%）=（OD对照-OD实验）OD对照X100%根据生长抑制的量效曲线求出IC50值肿瘤细胞存活率（%）=OD实验OD对照X100%AB问题：根据上图中细胞生长抑制曲线，判断化合物A和B哪一个具有较好的肿瘤生长抑制作用？Ｂ）磺酰罗丹明B（SRB）实验原理：SRB是粉红色的氨基甲氧杂蒽类化合物，是蛋白结合染料，与蛋白质的碱性氨基酸结合后呈粉红色，用酶标仪测定其吸光度。细胞中的蛋白含量与吸光度成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目和活性。方法：类似于ＭＴＴ法，10-20%三氯乙酸固定1h后，加入0.5-1%ＳＲＢ染色30min，洗去染料，空气干燥后，加入10mMTris溶解后，5４0nm测定光密度结果处理：同ＭＴＴ法Ｃ）细胞排染法（酞酚蓝）原理：细胞损伤或死亡后细胞膜完整性被破坏，正常细胞排染，而死亡细胞染成蓝色。伊红、苯胺黑等染料细胞死亡率（%）对照组活细胞数－给药组活细胞数对照组活细胞数X100%=结果：方法：细胞悬液加入酞酚蓝染色液混匀，用细胞计数板，分别计数活细胞（未染色）和死细胞数目（蓝色）２.诱导肿瘤细胞分化实验NBT还原法原理：硝基蓝四氮唑兰(NBT)还原法测定细胞株分化诱导。正常的中性粒细胞内磷酸戊糖支路活跃,细胞内还原型辅酶含量增加,将可溶性NBT还原为不溶性蓝紫色颗粒,而沉积于细胞浆内。方法：HL-60细胞株是筛选分化诱导剂的,药物作用后,细胞形态向粒细胞方向分化。结果：显微镜计数NBT还原阳性细胞，计算诱导分化率对照组药物处理组３.诱导肿瘤细胞凋亡实验Ａ）形态学观察（透射电镜）原理：细胞超微结构观察方法：药物处理后，收集细胞，4%戊二醛固定2h以上，PBS清洗，1%俄酸固定1h,酒精丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，切片做成铜网，经醋酸铀、枸橼酸铅染色，透射电镜下观察拍照。对照组凋亡细胞正常细胞胞质散在内质网、核膜清楚、染色质均匀、核仁明显。凋亡细胞染色质浓缩、致密，沿核分布形成新月体状，有凋亡小体出现。对照组坏死线粒体肿胀凋亡细胞胞质出现明显的线粒体肿胀。坏死细胞细胞膜不完整，核膜破裂，染色质呈虫蚀状溶解。B）DNA形态观察（Hoeschst333258）原理：Hoeschst333258与DNA特异性结合发出蓝色荧光方法：肿瘤细胞用Hoeschst333258染色后，在荧光显微镜下观察结果：活细胞成均匀的淡荧光，调亡细胞核或细胞质内可见强荧光的颗粒状物质。对照组药物处理组C）染色体ＤＮＡ断裂测定原理：凋亡细胞内源性核酸酶激活，ＤＮＡ链被切割成200bp不同倍数的片段，将这些片断进行电泳，可观察到ＤＮＡ梯带方法：裂解肿瘤细胞，消化蛋白，提取ＤＮＡ，上凝胶电泳，ＥＢ染色后，ＵＶ灯下观察。结果：凋亡细胞显示ＤＮＡ梯带。CTLDRUG1DRUG2MARKER３）PI/Annexin-Ｖ-FITC双染色分析原理：调亡细胞磷脂酰丝氨酸（PS）暴露于细胞表面，PS结合标记荧光素FITC的Annexin-V但细胞膜仍然完整，荧光染料ＰＩ不能进入，而调亡晚期的细胞可同时受Annexin-V和PI的双标记。方法：肿瘤细胞同时加入Annexin-Ｖ和ＰＩ染色，用流式细胞仪分析。正常细胞Annexin-V(-)PI(-)晚期凋亡细胞Annexin-V(+)PI(+)早期凋亡细胞Annexin-V(+)PI(-)Annexin-VPIPI/AnnexinV-FITC双染激光共聚焦分析结果PI红色荧光细胞核AnnexinV-FITC绿色荧光细胞膜Annexin-V-FITCPI对照组药物处理组４.抗肿瘤血管生成实验肿瘤发生、生长和转移与新生血管形成密切相关，当肿瘤直径超过2mm时,直接由微环境提供的营养就不能满足其生长需要,此时肿瘤的生长依赖于新生血管运送营养物质。肿瘤血管生成抑制剂能抑制血管生成,阻止肿瘤生长和转移，在治疗肿瘤中具有高效、广普、副作用小、不易产生耐药性等优点。１）血管内皮细胞体外筛选模型原理：体外培养的血管内皮细胞在含生长因子条件下能形成细胞条索，然后形成管状。肿瘤血管生成抑制剂能抑制细胞管腔的形成。方法：人脐静脉血管内皮细胞在含有药物和不含有TAI药物的胶原凝胶中分别培养后,在显微镜下比较它们形成的管腔数目。对照组药物处理组２）鸡胚绒毛尿囊膜血管新生模型原理：鸡卵在胚胎发育过程中，尿囊膜上的血管生长很旺盛，将不同药物作用于尿囊膜，观察该膜上的血管生长。方法：鸡胚胎放在直培养皿内,在无菌恒温箱中孵育到第9天的生长高峰时,将浸泡过药物的明胶海绵置于鸡胚绒毛尿囊膜表面，培养２天，在显微镜下