第六讲蛋白质的生物合成

1第六讲蛋白质的生物合成什么是蛋白质生物合成或翻译？一、蛋白质生物合成过程中的物质1、mRNA是合成蛋白质的直接模板在1956年-1961年期间，由Jacob等人领导的四个不同的实验室，通过用T4噬菌体感染大肠杆菌，发现了真正的模板。T4噬菌体感染后，宿主细胞E.coli的RNA合成停止，转录出的RNA仅来源于T4DNA，T4RNA的碱基组成不仅与T4DNA非常相似，而且能与tRNA和E.coli核糖结合。但并不是核糖体本身的构成成份。因为T4RNA携带T4DNA来的遗传信息，并在核糖体上指导合成蛋白质，所以称为信使RNA(messengerRNA)。到目前为止，所发现的mRNA都有合成一种多肽链的信息。它们具有一些共同的结构特征。例如，成熟的卵清蛋白mRNA含1859个碱基。在5‘端有一个“帽子”(5’-Cap)，3‘端含多聚腺苷酸(polyA)序列。在5’端非翻译顺序(64个碱基)和3‘端非翻译顺序(637个碱基)之间是翻译区或编码区(长1158个碱基)。2、遗传密码1）定义：mRNA中蕴藏遗传信息的碱基顺序称为遗传密码（Geneticcode）。mRNA中每个相邻的三个核苷酸，这个三联体称为一个密码子(codon)，因此，密码是密码子的总和。2）遗传密码的破译基因密码的破译是六十年代分子生物学最辉煌的成就。先后经历了五十年代的数学推理阶段和1961-1965年的实验研究阶段。1954年，物理学家GeorgeGamov根据在DNA中存在四种核苷酸，在蛋白质中存在二十种氨基酸的对应关系，做出如下数学推理：如果每一个核苷酸为一个氨基酸编码，只能决定四种氨基酸(41=4)；;如果每二个核苷酸为一个氨基酸编码，可决定16种氨基酸(42=16)。上述二种情况编码的氨基酸数小于20种氨基酸，显然是不可能的。那么如果三个核苷酸为一个氨基酸编码的，可编64种氨基酸(43=64)；若四个核苷酸编码一个氨基酸，可编码256种氨基酸(44=256)，以此类推。Gamov认为只有43=64这种关系是理想的，因为在有四种核苷酸条件下，64是能满足于20种氨基酸编码的最小数。而44=256以上。虽能保证20种氨基酸编码，但不符合生物体在亿万年进化2过程中形成的和遵循的经济原则，因此认为四个以上核苷酸决定一个氨基酸也是不可能的。1961年，Brenner和Grick根据DNA链与蛋白质链的共线性(colinearity)，首先肯定了三个核苷酸的推理。随后的实验研究证明上述假想是正确的。破译密码的实验研究先后由三个实验逐步发展了四种破译方法，于1965年完成。1)在体外无细胞蛋白质合成体系中加入人工合成的polyＵ开创了破译遗传密码的先河。自1961年发现mRNA后，许多实验室开始在无细胞蛋白质合成系统中加入mRNA，去研究蛋白质生物合成过程，并表明加入mRNA能刺激无细胞系统中蛋白质合成。1961年，美国NIH的Nirenberg和Mathaei，设想：即然mRNA有刺激无细胞系统中的蛋白质合成作用，加入人工合成的多聚核苷酸亦将会有这种促进作用。按此设想，他们合成了polyU作为模板，以观察无细胞系统中蛋白质合成速率。因为在反应体系中加入高Mg2+浓度，可有利于IF(起始因子)的作用和fMet-tRNANet的形成，从而保证肽链合成的起始不需mRNA的适当信号。当把翻译产物分离、纯化和做序列分析后，结果出乎意料，合成的肽链中的氨基酸残基全部是苯丙氨酸，即polyPhe。于是第一次确认了UUU是Phe的密码子。这样，就在一个偶然的机会开创了破译密码的工作。随后，他们又以polyA和polyC为模板，证明了分别可指导合成polyLys和polyPro，即确定了AAA是Lys的密码子，CCC是pro的密码子。但是类似的实验不能证明GGG是何种氨基酸的密码子，因为polyG产生牢固的氢键结合，形成三股螺旋，而不与核糖体结合。2)混合共聚物(mixedcopolymers)实验对密码子中碱基组成的测定：1963年，Speyer和Ochoa等发展了用两个碱基的共聚物破译密码的方法。例如，以A和C原料，合成polyAC。polyAC含有8种不同的密码子:CCC、CCA、CAA、AAA、AAC、ACC、ACA和CAC。各种密码子占的比例随着A和C的不同而不同，例如当A和C的比例等于5:1时，AAA:AAC的比例=5×5×5:5×5×1=125:25。依次类推。实验显示AC共聚物作模板翻译出的肽链由六种氨基酸组成，它们是Asp，His，Thr，Pro，和Lys，其中Pro和Lys的密码子早先已证明分别是CCC和AAA。根据共聚物成份不同的比例和翻译产物中氨基酸比例亦不同的关系，Speyer等确定了Asp、Glu和Thr的密码子含2AlC；His的密码子含1A2C；Thr的密码子也可以含1A2C；Pro为3C或1A2C；Lys为3A。但上述方法不能确定A和C的排列3方式，而只能显示密码子中碱基组成及组成比例。例如，Asp，Glu和Thr的2A1C可能有三种排列方式，即AAC、ACA、CAA。此外，通过反复改变共聚物成份比例的方法亦十分麻烦和费时。3)aa-tRNA与确定的三核苷酸序列(密码子)结合：正当Speyer等人按上述2)方法奋力时，Nirenberg和Leder于1964年建立了破译密码的新方法，即tRNA与确定密码子结合实验。该方法利用了如下事实：即是在缺乏蛋白质合成所需的因子的条件下，特异氨基酸-tRNA(aa-tRNA)也能与核糖体-mRNA复合物结合。最重要的是这种结合并不一定需要长的mRNA分子，而三核苷酸实际上就可以与核糖体结合。例如，当polyU与核糖体混合时，仅有Phe-tRNA(苯丙氨酰-tRNA)与之结合；相应地Pro-tRNA(脯氨酰-tRNA)特异地与polyC结合。还有GUU可促进Val-tRNA(缬氨酰-tRNA)结合，UUG促进Leu-tRNA(亮氨酰-tRNA)结合等。虽然所有64个三核苷酸(密码子)都可按设想的序列合成，但并不是全部密码子均能以这种方法决定因为有一些三核苷酸序列与核糖体结合并不象UUU或GUU等那样有效，以致不能确定它们是否能为特异的氨基酸编码。4)用重复共聚物(repeatingcopolymers)破译密码：几乎在上述Nirenberg和Leder工作的同时，Nishimura，Jones，和Khorana等人应用有机化学和酶学技术，制备了已知的核苷酸重复序列。蛋白质在核糖体上的合成可以在这些有规律的共聚物的任一点开始，并把特异的氨基酸参入肽链。例如，重复序列CUCUCUCUCU......是多肽Leu-Ser-Leu-Ser......或者是多肽Ser-Leu-Ser......的信使分子。使用共聚物构成三核苷酸为单位的重复顺序，如(AAG)n，它可合成三种类型的多肽：polyLys、polyArg和polyGlu，即AAG是Lys的密码子，AGA是Arg的密码子，GAA是Glu的密码子。又如（AUC)n序列是polyIle、polySer和polyHis的模板。如此至1965年破译了所有氨基酸的密码子。3）遗传密码子具有以下基本特点：（1）每个密码子三联体(triplet)决定一种氨基酸；（2）两种密码子之间无任何核苷酸或其它成分加以分离，即密码子无逗号；（3）密码子具有方向性，例如AUC是Ile的密码子，A为5'端碱基，C为3'端碱基。因此密码也具有方向性，即mRNA从5'端到3'端的核苷酸排列顺序就决定了多肽链中从N端到C端的氨基酸排列顺序;（4）密码子有简并性(degeneracy)，一种氨基酸有几个密码子，或者几个密码子代表一种氨基酸的现象称为密码子的简并性。除了Met和Trp只有一个4密码子外，其它氨基酸均有二个以上密码子，例如Arg有6个密码子。（5）共有64个密码子，其中AUG不仅是Met或者fMet(在原核细胞)的密码子，也是肽链合成的起始信号，故称AUG为起始密码子。UAA、UAG和UGA为终止密码子，不代表任何氨基酸，也称为无意义密码子。（6）密码子有通用性，即不论是病毒、原核生物还是真核生物密码子的含义都是相同的。但真核细胞线粒体mRNA中的密码子与胞浆中mRNA的密码子有以下三点不同：一是线粒体中UGA不代表终止密码子，而是编码Trp；二是肽链内的Mer由AUG和AUA二个密码子编码，起始部位的Met由AUG、AUA、AUU和AGG均为密码；三是AGA和AGG不是Arg的密码子，而是终止密码子，即UAA、UAG、AGA和AGG均为终止密码子。（7）密码子结构与氨基酸侧链极性之间有一定关系。A氨基酸侧链极性性质在多数情况下由密码子的第二个碱基决定。第二个碱基为嘧啶(Y)时，氨基酸侧链为非极性，第二个碱基为嘌呤(P)时，氨基酸侧链侧有极性。B当第一个碱基为U或A，第二个碱基为C，第三个碱基无特异性时，所决定的氨基酸侧链为极性不带电；C当第一个碱基不是U，第二个碱基是G时，氨基酸侧链则带电。在此前提下，若第一个是C或A时，表示带正电的氨基酸;第一、第二个碱基分别是G、A时，此种氨基酸带负电。但上述关系也有个别例外。（8）摆动性转运氨基酸的tRNA的反密码需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码反向配对结合，但反密码与密码间不严格遵守常见的碱基配对规律，称为摆动配对。一度认为在tRNA上的反密码子(anticodon)只能识别一种密码子。后来发现二个事实不能用这种理论解释。一是纯化的tRNAAla(随后也证明了其它tRNA)可识别几种不同的密码子。二是某些反密码子中含稀有核苷酸次黄嘌呤核苷酸(1)I并不按标准配对，但与密码子中的三种碱基形成氢键。对于一种tRNA能识别几种密码子的现象，Crick(1966)提出了所谓摆动假说(Wobblehypothesis)，他认为碱基间除标准配对外，还可以有非标准的配对，即密码的第一、第二碱基是必需严格按标准配对(A-U、G-C)而第三碱基则不然，它的配对不如此严格，可以有一定程度的摆动灵活性，但也不是可以任意组合。例如，反密码子5'端的G可以与密码子3'端的C或U配对；但反密码子5'端的C或A却必需严格地按标准配对，不得摆动。一般说来，摆动假说是正确的，但有一个例外，tRNAGly的反密码子3'CCA5'可识别5Gly密码子5'GGC3'。摆动规则所允许的碱基间配对，必须满足核-核糖间距接近于标准碱基间距(G-C间为1.08nm，A-U间为1.1nm).嘌呤间或嘧啶间的配对全导致核糖-核糖间距过大或过小。摆动规则并不允许任何一种tRNA去识别四种以上不同的密码子。事实上只有当I占据反密码子第一位(5'端)时，该反密码子才能识别三种密码子，例如三种tRNASer(tRNASer，tRNASer，tRNASer)能识别Ser的六种密码子(UCU、UCC、UCA、UCGⅠⅡⅢ、AGU和AGC)。从80年代中期所建立的tRNA三维结构表明，反密码子的第一位碱基在摆的一端，它的移动受限性比其它二个碱基要小。相反，反密码子的第三位碱基不仅处在摆的中间，而且其3'端毗邻碱基部是烷基化修饰的嘌呤，这样该碱基的移动性严格受限。因此，反密码子的5'端碱基在与密码子3'端碱基配对时，可产生一定范围的摆动。（9）专一性mRNA上的密码子的第一、第二个碱基与tRNA上的反密码子相应的碱基形成强的配对；密码的专一性主要是由这两个碱基对的作用。有些反密码子的第一个碱基（按5’-3’）决定了该tRNA识别密码子的数目。当一种氨基酸有几个密码子时，只要他们的第一和第二个碱基中有一个不同，则需要不同的tRNA来识别。开放阅读框架(openreadingframe,ORF)从mRNA5端起始密码子AUG到3端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链。2、tRNAtRNA是分子最小，但含有稀有碱基最多的RNA，其稀有碱基的含量可多达20%。1958年Hoagland等人首先发现了在蛋白质生物合成过程中，一种可溶性RNA起介导作用，称为可溶性R