第十一章原生质体的分离和培养

第十一章原生质体的分离和培养1引言植物原生质体培养和细胞融合是植物细胞工程的核心技术，它是20世纪60年代初，人们为了克服植物远缘杂交的不亲和性，利用远缘遗传基因资源改良品种而开发完善起来的一门技术。植物原生质体是遗传转化的理想受体，能够比较容易地摄取外来遗传物质，如外源DNA、染色体、病毒、细胞器等，为高等植物在细胞水平或分子水平上的遗传操作提供了理想的实验体系。原生质体是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。就单个细胞而言，除了没有细胞壁外，它具有活细胞的一切特征。1960年英国植物生理学家Cocking首次利用纤维素酶等从番茄根细胞分离原生质体获得成功。1971年Takebe等培养烟草叶片原生质体获得再生植株，首次证实了原生质体的全能性。1972年美国科学家Carl．son等利用细胞融合技术，首次获得两种不同烟草原生质体融合的体细胞杂种。1974年高国楠等开发出了PEG（聚乙二醇）融合方法。1978年德国科学家Melchers等把马铃薯和番茄的原生质体进行融合，获得了体细胞杂种——马铃薯番茄。1981年Zimmermann开发出了高压脉冲法，即电融合技术。植物原生质体培养和细胞融合技术已经成熟，并成为品种改良和创造育种亲本资源的重要途径。迄今已在多种作物上获得了原生质体植株和种、属间杂种植株，也为细胞生物学、植物生理学及体细胞遗传学的研究做出了重要贡献。第一节植物原生质体分离一、原生质体分离(一)植物细胞膜电特性和膜电位植物细胞膜是一个由脂类和蛋白质等构成的双层分子层膜，其物理性质类似于一个双电层，细胞的内外层带的是同种电荷。不同植物的细胞膜电位不同，同种植物细胞倍性不同以及在不同外界离子环境下，其细胞膜的膜电位也不同(表7-1、表7-2)。了解植物细胞膜的电特性对细胞融合的研究很有-必要。原核生物遗传饰变过去几十年取得了很大进展，转导和转化现已成为对微生物进行遗传操作的标准方法。利用微生物进行遗传操作研究的优点是：①这些单细胞和单染色体系统既简单又容易控制；②它们的复制周期很短。在真核生物中将遗传物质由一个个体转移给另一个个体的传统方法是有性杂交，它所能进行的范围极为有限，尤其在动物中是这样。就是在植物中，虽然远缘杂交并非不可能，但由于有性不亲合性的障碍，有时在选定的亲本之间也难以获得完全的杂种(见第9章和第10章)，这是通过杂交进行作物改良的一个严重障碍。在这点上细胞融合为远缘杂交提供了一个很有潜力的新途径(体细胞杂交)。无论是在植物中还是在动物中，细胞融合必须穿越质膜才能完成。植物与动物不同，在质膜之外还有一层坚硬的纤维素壁，相邻的细胞被一层主要由果胶质构成的基质粘连在一起。主要由于这个原因，体细胞遗传学在动物中的发展远远超过了在植物中的发展。只是自1960年以来，由于Cocking证实了通过酶解细胞壁可以获得大量有活力的裸细胞(原生质体)，对高等植物体细胞遗传饰变的真正兴趣才与日俱增。实际上，这一领域的研究甚至是更晚——1970．年以后——才活跃起来的。高等植物原生质体除了可用于细胞融合的研究以外，还能通过它们裸露的质膜摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒。原生质体的这些特性与植物细胞的全能性结合在一起，已经在遗传工程和体细胞遗传学中开辟了一个理论和应用研究的崭新领域。通过原生质体系统对植物细胞进行遗传饰变方法的要点是：①原生质体的分离；②培养原生质体并使之再生完整植株；⑧细胞融合；④把外源遗传物质、细胞器或微生物导人原生质体。本章讨论原生质体分离和培养的技术，现将其主要环节示于图11．1，与体细胞杂交有关的细胞融合和离体原生质体在其他方面的应用将在第12章中讨论。图11．1叶肉原生质体的分离、培养和植株再生(71自Bajaj，1977)11．2原生质体的分离11．2．1原生质体分离的方法11．2．1．1机械法由高等植物中分离原生质体的研究最早是Klercker在1892年进行的。当时他所用的主要是机械法—把细胞置于一种高渗的糖溶液中，使细胞发生质壁分离，原生质体收缩成球形，然后用利刃切割。在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的原生质体。在某些贮藏组织中，如洋葱的鳞片、萝卜的根、黄瓜的中皮层、甜菜的根组织等，应用这个方法可由它们高度液泡化的细胞中分离出原生质体。然而，这个方法有明显的缺点：一是产量很低，二是在由分生细胞和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不适用。11．2．1．2酶解法1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分离原生质体的可能性。他使用了一种由疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液以降解细胞壁。然而，进一步的研究只是到了有商品酶供应之后才成为可能。自从1968年纤维素酶和离析酶投入市场以后，植物原生质体才变成了一个热门的研究领域。首先用商品酶进行原生质体分离的是Takebe等(1968)。在他们分离烟草叶肉原生质体的程序中，上述两种酶是依次使用的，即先用离析酶处理叶片小块，使之释放出单个细胞，然后再以纤维素酶消化掉细胞壁，释放出原生质体。Power和Cocking(1968)证实，这两种酶也可一起使用。这种“同时处理法”或“一步法”比“顺序处理法”快，并且由于减少了步骤，从而减少了微生物污染的机会。多数研究者现在都使用这种简化的一步法，这种方法的细节见附录11．1。现在市面上有各种酶制品出售(表11．1)．取决于组织性质的不同，它们可以不同配比搭配使用。表11．1存厦毕后佐分离审常用的商品醢酶来源生产厂家纤维素酶类OnozukaR一10MeicelasePCellulysinDriseIase绿色木霉绿色木霉绿色木霉IrpexlutensYakultHonshaCo．Ltd．，Tokyo，JapanMeijiSeikaKaishaLtd．，Tokyo，JapanCalbiochem．，SanDiego，CA92037，USAKayowaHakkoKogyoCo．，Tokyo，Japan果胶酶类MacerozymeR-lOPectinasePectolyaseY－23根霉黑曲霉日本黑曲霉YakultHonshaCo．Ltd．，Tokyo，JapansigmaChemicalCo．，St．Louis，MO63178，USAseishinPharm．Co．Ltd．，Tokyo，Japan半纤维素酶类RhozymeHP-150Hemicellulase黑曲霉黑曲霉RohmandHaasCo．，Philadelphia，PA19105，USASigmaChemicalCo．，St．Louis，M063178，USA由于商品酶的出现，现在实际上已有可能由每种植物组织分离出原生质体，只要该组织的细胞还没有木质化即可。据报道，由以下各种组织中都已分离出原生质体：叶肉细胞，根组织，豆科植物的根瘤，茎尖，胚芽鞘，块茎，花瓣，小孢子母细胞，果实组织，糊粉细胞，下胚轴和培养的细胞等。有活力和适于培养的原生质体的大量分离受到若干因素的影响，一个实验体系所需的最适条件主要是靠经验确定的。在想用一个新的实验系统分离原生质体时，可以参考Uchimiya和Murashige(1974)在烟草培养细胞上所做的工作，和Scott等(1978)在禾谷类植物叶肉组织上所做的工作(见表11．2)。表11．2在两个物种中原生质体分离的最适条件项目烟草的培养细胞①禾谷类叶肉细胞②植物材料纤维素酶果胶酶(离析酶)半纤维素酶酶溶液的pH酶溶液容积／组织鲜重保温时间最适温度4～5日龄继代培养物1％OnozukaR－10O.1％～O.2％OnozukaR－lO——4.7或5.710ml／g2～3h22～37℃5～6日龄幼苗2％CellulysinO.5％1％4.6～5.410m1／g2h20～25℃80r／min振荡速度渗压剂50r／min300～800mmol／L甘露醇600mmo|／L山梨醇①引自Uchimiya和Murashige(1974)；②引自Scott等(1978)。由叶肉细胞分离原生质体的方法见附录11．1(同时见图11．2)。图11.2分离叶肉原生质体的技术流程(引自E．C．Cocking)11．2．2影响原生质体产量和活力的因子11．2．2．1材料来源植物原生质体最方便和最普遍的来源是叶片，因为由叶片中可以分离出大量的比较均匀一致的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。当由叶片制备原生质体时，植株的年龄和生长条件十分重要。为了能在最大程度上控制供体植株的生长条件，一些作者使用了离体培养的植物，对这些植物的叶片无须进行表面消毒。不过多数作者还是使用温室或生长室栽种的植物，在这种情况下，一般以生长在下述条件下的植株能产生较好的结果：低光照强度(1000μW／cm2。)，短日照，温度范围20～25℃，相对湿度60％～80％，以及充足的氮肥供应。由于从禾本科和其他一些物种的叶肉细胞分离适于培养的原生质体相当困难，因此在这些植物中一直用培养细胞作为供体材料。培养细胞的原生质体产量取决于这些细胞的生长速率和生长时期。频繁继代(每3d一次)的悬浮培养物以及处于对数生长早期的细胞，是最适宜的供体材料。11．2．2．2前处理由生长在非无菌条件下的植株上取来的组织，首先必须进行表面消毒。一般来说，消毒方法与第2章中介绍的用于组织和器官培养的消毒方法相同。根据Scott等(1978)的实验结果，对禾谷类植物叶片进行表面消毒时，效果最好效率最高的方法是把它们用苄烷铵(Zephiran)(O.1％)一酒精(10％)溶液漂洗5min。叶片表面消毒的另一种方法是用609／6～70％的酒精漂洗，然后再在超净工作台上使叶表面的酒精蒸发掉。要保证酶解能充分进行，必须促使酶溶液渗入到叶片的细胞间隙中去，为达到这个目的可以采用几种不同的方法，其中应用最广泛的方法是撕去叶片的下表皮，然后以无表皮的一面向下，使叶片飘浮在酶溶液中。如果叶片的下表皮撕不掉或很难撕掉，则可把叶片或组织切成小块(约1mm。)，投入到酶溶液中。若与真空渗人相结合后，后一种方法不但十分方便，而且也非常有效。据Scott等(1978)报道，若以真空处理3～5rain，使酶溶液渗入叶片小块，在2h内即可把禾谷类植物的叶肉原生质体分离出来。检查酶溶液是否已充分渗入的标准，是当真空处理结束后大气压恢复正常时叶片小块能否下沉。代替撕表皮的另一种有效方法是用金刚砂(246目)摩擦叶的下表面。在酶处理期间进行搅拌或振动可以增加培养细胞的原生质体产量。11．2．2．3酶处理原生质体分离的情况在很大程度上取决于所用酶的性质和浓度。分离植物细胞原生质体所必需的两种酶是纤维素酶和果胶酶，后者的作用主要是降解中胶层，前者是消化细胞壁纤维素。市售的最早真菌酶制品是Onozuka纤维素酶SS和Onozuka离析酶SS，这两种酶一直得到了广泛的应用。由于对这类酶的需求与日俱增，现在又有其他很多公司进行这类酶的生产(见表11．1)。崩溃酶同时具有纤维素酶、果胶酶、地衣多糖酶和木聚糖酶等几种酶的孵解活性，对于由培养细胞中分离原生质体特别有用。即使是纯化的酶，如纤维素酶R－10，看来也含有相当数量的果胶酶。果胶酶Y一23是一种效力很高的离析酶，若与纤维素酶结合使用，可在30min内由豌豆叶肉细胞中把原生质体释放出来。对于某些组织来说，除了纤维素酶和离析酶之外可能还需要半纤维素酶。大麦的糊粉细胞以纤维素酶处理之后并不能把原生质体释放出来，这是因为在原生质体周围还留下一薄层抗纤维素酶的壁。这类细胞称作原生质球，只有用Glusulase酶处理才能把它们剩余的壁消化掉。粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质，它们对原生质体的活力可能是有害的。因此有些研究者常在使用之前将这些酶纯化，方法是使它们通过聚丙烯酰胺凝胶或葡聚糖凝胶G25进行过滤洗提。不过在多数情况下，这些酶的粗制形式也能产生令人满意的结果。确实，Arnold和Eriksson(1976)观察到，酶的纯化会