第十一章微生物的应用

第十一章微生物的应用微生物学教案11－1第十一章微生物的应用本章提要：微生物不仅数量多，而且代谢类型多样，可以通过不同途径降解环境中的污染物(如以农药作为营养物加以利用或通过共代谢加以除解；利用加氧酶转化、除解烃类污染物等)，通过改变重金属存在形式而降低其对环境的污染,微生物在环境保护中占有重要地位，活性污泥法和生物膜，因其方便、实用、成本低、效果好，已成为污水处理的主要方法。在环境监测中，生物监测以其既能反映多种污染物的综合效应，又能反映环境污染的历史状况的独特作用，已成为环境监测的主要方法。植物的害虫和害虫的天敌是自然界生态平衡的一个片段，害虫的天敌也包括杀死害虫的微生物，杀虫微生物已报道的有近一千七百种，包括细菌、真菌、病毒、立克次氏体和原生动物。任何一种杀虫微生物都有一定的专性，如果它对人、畜、植物和害无害，能对某些害虫有杀害能力，就有可能利用它防治害虫。至今，已经实用的杀虫微生物种类是很少的，还有一些正在发掘和研究中。按照杀虫微生物的主要特点，可以分为两大类，一类是含有杀死害虫的生物毒素，例如，苏云金杆菌等等，它们被敏感害虫吞食，或由其它途径侵入虫体后，敏感害虫中毒死亡；另一类是敏感害虫的传染性病原体，敏感害虫被感染后发病、致死，并且成为传染源，扩散开，成为敏感害虫的流行病害。例如，白僵茵(真菌)，金龟子乳状病杆菌(细菌)和各种昆虫病毒等等。害虫和杀虫微生物是自然界生态平衡的一个片段，要应用杀虫微生物来防治害虫，就需要了解杀虫微生物杀死害虫的机制和条件，大量繁殖杀虫微生物，制成生物杀虫剂，按照最有效的方法，在最适宜的条件施用，消灭或削弱害虫的发展和为害，取得防治害虫的实效。微生物和外界环境关系十分密切，环境条件适宜时，微生物生长繁殖；环境条件不适宜时微生物代谢改变，生长繁殖受到抑制甚至引起死亡。反过来，微生物的生长繁殖也影响外界环境，对人类而言，微生物有其有益的方面也同时存在危害人类的方面。因此人类必须对环境中的有害微生物施加影响，控制其生长繁殖。一般来说，通过消毒、灭菌、防腐、化疗等手段可能达到消灭有害微生物的目的。本章重点和难点：微生物接种剂的特性和在农业生产中的应用，微生物在生物防治中的作用，有机肥料积制的微生物学过程。11.1微生物接种剂11.1.1接种剂的性质接种剂主要有两大类：一类是提高土壤供肥能力并提供植物养料；另一类是防治植物病虫害和消除杂草(也称为微生物农药)。利用有益微生物为植物提供有效养料和促进生长的微生物接种剂，简称菌剂(也称为细菌肥料或生物肥料)。菌剂同一般有机和无机肥料有很大区别，它在单位面积上的用量微少，所以菌剂不是直接作为植物的养料或药物，而是靠它们在土壤中或植物表面大量繁殖，进行旺盛的代谢作用，才有可能起到供肥的作用。所以接种剂这一术语较好地反映了它的一般性质和作用，它同其它肥料的区别是十分明显的。菌剂既然是起接种的作用，很明显，作为接种剂的微生物必定是经过研究确定了它的性状后，才能用于商品生产。(要求有结瘤能力强、固氮效率高、竞争优势强的特性)。近20年来，我国生产且使用比较多的是根瘤菌接种剂，效果比较好。(如下表)第十一章微生物的应用微生物学教案11－2紫云英施用根瘤菌接种剂的增产效果对照区产量试验鲜草产量(斤/亩)增产量增产率分级(斤/亩)点数对照接种剂(斤/亩)(%)2000以下17110233892287207.522000~50005534095377196857.715000以上3961877720153124.7411.1.2根瘤菌接种剂的应用目前推广应用根瘤菌接种剂存在以下几方面问题：①菌种的退化问题；②老区接种根瘤菌接种剂的效果问题；③接种剂质量问题。1.应用方法根瘤菌的田间应用传统上有两种基本方法，即种子拌菌和土壤混菌。它们各有利弊，需要改进和完善。图11-1根瘤菌结瘤的位置效应表11-1大豆根瘤菌不同施用方法对共生效应的影响固氮量固氮率(植物含氮产量施用方法(kgN2/hm2)量中来自大气的%)(t/hm2)种子拌菌40304.6土壤混菌66475.0接种剂施于播种层55365.5接种剂施于播种层5cm以下63465.3不接种--4.72.应用时间为了方便，根瘤菌剂多在播种时施用，但也可以在播种前后施用，必要时施用几次，以提高接种效果。①播种前种子可以在播种前几个月或一年以上进行拌种，由厂家或种子公司做成丸衣化种子出售。②播种时在播种的同时施用根瘤菌是最常采用的方法，可以进行种子拌菌，也可以土壤混菌。③播种后播种后再接种根瘤菌剂只是作为一种补救办法，当结瘤不好时追施一、二次菌剂可以提高结瘤率。11.2微生物农药(杀虫微生物)11.2.1微生物农药的性质和种类植物的害虫和害虫的天敌是自然界生态平衡的一个片段，害虫的天敌也包括杀死害虫的微生物，杀虫微生物已报道的有近一千七百种，包括细菌、真菌、病毒、立克次氏体和原生动物。任何一种杀虫微生物都有一定的专性，如果它对人、畜、植物无害，能对某些害虫有杀害能力，就有可能利用它防治害虫。至今，已经实用的杀虫微生物种类是很少的，还有一些正在发掘和研究中。按照杀虫微生物的主要特点，可以分为两大类，一类是含有杀死害虫的生物毒素，例如，苏云金杆菌等等，它们被敏感害虫吞食，或由其它途径侵入虫体后，敏感害虫中毒死亡；另一类是敏感害虫的传染性病原体，敏感害虫被感染后发病、致死，并且成为传染源，扩散开，成为敏感害虫的第十一章微生物的应用微生物学教案11－3流行病害。例如，白僵茵(真菌)，金龟子乳状病杆菌(细菌)和各种昆虫病毒等等。要应用杀虫微生物来防治害虫，就需要了解杀虫微生物杀死害虫的机制和条件，大量繁殖杀虫微生物，制成生物杀虫剂，按照最有效的方法，在最适宜的条件施用，消灭或削弱害虫的发展和为害，取得防治害虫的实效。(利用自然界中某些生物控制虫害、病害及其它有害生物的方法称为生物防治，对有害生物起控制作用的生物称为天敌。微生物是天敌的一种类型。用它们防治害虫，称为以菌治虫；用它们来抑制植物的致病微生物或防治病害，称为以菌治菌或以菌治病。微生物农药即把经研究，筛选出的控制病虫害能力强，效率高，对人畜无害的优良菌种所制成的制剂(包括微生物杀虫剂和杀菌剂)。这类农药对人畜安全、对天敌无影响、不易引起防治对象产生抗药性、对环境不会带来污染。)11.2.2微生物对害虫的防治1.细菌杀虫剂目前已发现的昆虫致病菌有已知的杀虫细菌有90多个种,大多数是芽孢杆菌,少数是无芽孢的细菌种类。如:苏云金杆菌、金龟子芽胞杆菌、缓死芽胞杆菌、球形芽胞杆菌、天幕梭菌、铜绿假单胞菌和金龟子立克次氏体等苏云金杆菌(B.T)A.苏云金杆菌的形态、培养特征和分类苏云金杆菌是G+的好气性芽孢杆菌,营养体大小1.0-1.2×3.0-5.0微米,两端钝圆,周生鞭毛,能运动,少数无鞭毛,它们单个或明或2—5个成链状。内生芽孢椭圆形或圆形,直径小于菌体的宽度,孢囊不膨大。在内生芽孢形成的同时,在孢囊内还形成伴孢晶体。苏云金形成伴孢晶体是它与蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)和其它近似种主要性状,也是苏云金杀虫的主要毒素成分。伴孢晶体具多种形态,典型的为梭状六面体,在显微镜下成菱形,也有四面体、圆形、方形和不规则形的。B.苏云金杆菌的毒素和毒力苏云金杆菌的主要毒素是伴孢晶体,又称-内毒素。它是一种蛋白质晶体,完整的伴孢晶体并无毒性,当它被敏感昆虫的幼虫吞食有,在肠道碱性条件和酶的作用下,或单纯在碱性条件下,伴孢警惕能水解成毒性肽,毒性肽的分子量大小依变种的不同而不同。当敏感幼虫吞食含伴孢晶体和芽孢的混合制剂后在肠道中被水解产生的毒性肽,很快发生毒性,幼虫停止取食,麻痹,进一步作用使中肠的上皮细胞遭受破坏,芽孢侵入血腔,并在那里萌发和繁殖使幼虫患败血症,同时肠液也进入血腔使血淋巴pH值上升,幼虫全身瘫痪,发黑,最终死亡。苏云金杆菌的一些变种除产生伴孢晶体毒素外,还分泌一种水溶性的苏云金素(thuringiensin)又称β-外毒素,由于它能忍耐121℃(15分钟)的高温和对家蝇幼虫有毒性,故又称热稳定外毒素或蝇毒素。它是一种腺嘌呤核苷酸的衍生物。苏云金素是光谱毒素,对较多目的昆虫有毒性。此外苏云金杆菌还能产生卵磷脂酶、叶蜂毒素等多种毒效成分。虽然伴孢晶体能用生化、免疫等方法定量测定,苏云金素能用化学方法进行测定,要全面反映苏金杆菌培养物或制剂的毒力,需采用生物测定法,即在规定条件下,测定杀死供试昆虫数的一半所需培养物(或制剂)的浓度(半致死剂量LD50),来表示毒力的大小。LD50值愈小,其毒力愈高；如猝倒亚种伴孢晶体对家蚕幼虫的LD50值为0.015μg/幼虫,以色列亚种的伴孢晶体对埃及伊蚊幼虫LD50值为0.00019μg/毫升。苏云金杆菌不同亚种,甚至同一亚种的不同菌株,对同一种昆虫或不同种昆虫的毒力是不相同的,可以用杀虫活性谱和毒力比表示菌株之间毒性的差异。C.苏云金杆菌制剂的生产、应用和安全性苏云金杆菌对营养的要求不严,能在常用的细菌培养基(如牛肉膏蛋白胨培养基)中生长快而旺盛、并形成芽孢和伴孢晶体。在以黄豆饼粉、棉子仁粉、玉米浆等农副产品为主要养料的深层发酵中进行大量培养,每毫升发酵液活芽孢数可达20—150亿(大致有同等数量的伴孢晶体)。发酵液加填充料经板框压滤浓缩后,用喷雾干燥法制成菌粉,或将发酵液浓缩(离心或真空减压浓缩)后,加助剂制成液剂、乳剂或油剂。苏云金杆菌制剂亦可用半固体发酵法进行生产。在农林、贮藏和环卫害虫中,大面积应用苏云金杆菌制剂防治取得显著效果的主要有：菜青虫、小菜蛾、稻苞虫、稻纵卷叶螟、棉造桥虫、玉米螟、茶毛虫、烟青虫、松毛虫、避债蛾、印度谷螟、米蛾、蚊和蚋等。不是任何苏云金杆菌亚种的制剂对它们都有效,要针对目标害虫选择不同种类的制剂。使用方法简便,喷雾、喷粉、撒毒土均可。必须注意的是在养蚕地区切忌对它们有毒的制剂污染到它们的生活环境和饲料中,以防蚕中毒死亡。第十一章微生物的应用微生物学教案11－4迄今分离的苏云金杆菌的各亚种和菌株对人、畜禽、水产无害,对植物无毒,是安全、无害、无残毒的杀虫剂,尤其适于飞机喷撒。对苏云金杆菌毒素敏感的主要是鳞翅目、双翅目和鞘翅目的部分昆虫的幼虫，如菜青虫、小菜蛾、稻苞虫、棉造桥虫、松毛虫、米蛾、蚊等。其杀虫原理为：当敏感性昆虫的幼虫吞食这种伴胞晶体后，在其碱性肠道中晶体被水解成毒性肽，产生毒性，此时，幼虫停止取食，麻痹，进而破坏中肠的上皮细胞，肠道内含物渗入血腔，pH下降，幼虫全身瘫痪，得败血症而死亡。金龟子芽胞杆菌和缓死芽胞杆菌是对鞘翅目害虫金龟子的幼虫----蛴螬有高度致病力的两种专性病原芽胞杆菌。当蛴螬吞食这种芽胞杆菌的芽胞后，芽胞萌发侵入血腔，并大量繁殖，使幼虫的血淋巴呈乳状，死亡幼虫呈乳白色，故又称为乳状病。金龟子芽孢杆菌金龟子芽孢杆菌(Bacilluspopilliae),(图14-3)和缓死芽孢杆菌(Bacillusleatimor-tus)是芽孢杆菌属的两个种,是一群对鞘翅目害虫金龟子的幼虫——蛴螬有高度致病力的一类专性病原芽孢杆菌。它对50多种蛴螬有毒性,当金龟子的幼虫吞食金龟子芽孢杆菌的芽孢后,芽孢萌发侵入血腔,并大量繁殖,使幼虫的血淋巴呈乳状,死亡幼虫呈乳白色,故又称为乳状病。金龟子芽孢杆菌在常用培养基中不生长,在加富培养基中有些菌株能缓慢生长,却不能形成或很少形成芽孢。因此,商品制剂Doom、Japidemic和MilkySpore都是采用幼虫活体培养的方法制备的。一般每头幼虫可产生2-5×109芽孢。金龟子芽孢杆菌施用后,不仅在施用范围内,而且能蔓延到施用点的周围,成为持久的环境因子,产生持续性的效益,将害虫控制在底水平。球形芽孢杆菌球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)是一种在自然界广泛分布的芽孢杆菌,大多数菌株对昆虫没有毒性,但从中发掘出了一些对蚊幼虫有高毒力的菌株。它的毒效成分在细胞内,不分泌到细胞外的培养液中。因此,只有昆虫吞食细胞后才显示毒性。球形芽孢杆菌和苏云金杆菌一样,对营养要求不严,能在通常的培养基中生长,迅速繁殖并形成芽孢,它适于发酵