第十一章非发酵革兰阴性杆菌

第十一章非发酵革兰阴性杆菌一、教学大纲要求（1）非发酵菌的概念、种类和初步鉴定特征。（2）假单胞菌属的分类、临床意义、细菌特性、实验室检查和耐药性。（3）铜绿假单胞菌的临床意义、细菌特性、实验室检查和耐药性。（4）荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、斯氏假单胞菌的临床意义、细菌特性和实验室检查。（5）不动杆菌属、寡养单胞菌属、产碱杆菌属和军团菌的临床意义、细菌特性、实验室检查和耐药性。（6）黄杆菌属和莫拉菌属的细菌特性和实验室检查。二、教材内容精要（一）非发酵菌的主要特点和分类非发酵菌（NonfermentativeBacilli）是一群不发酵葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖的需氧或兼性厌氧、无芽胞的革兰阴性杆菌；在分类学上分别属于不同的科、属和种，但生化特征十分接近，多为条件致病菌，主要引起院内感染。非发酵菌包括的菌种较多，主要有下列菌属：假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、伯克菌属（Burkholderia）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、无色杆菌属（Achromobacter）、莫拉菌属（Moraxella）、金氏杆菌属（Kingella）、黄杆菌属（Flavobacterium）、艾肯菌属（Eikenella）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、丛毛单胞菌属（Comamonas）、食酸菌属（Acidovorax）等。若某种未知的革兰阴性杆菌具有以下一种或几种特征，则怀疑其为非发酵菌：1.氧化发酵试验常显示是氧化型或产碱型。2.氧化酶阳性，非发酵菌中，除不动杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌外氧化酶试验均为阳性。但并非所有氧化酶阳性的革兰阴性杆菌都是非发酵菌，如巴斯德菌、气单胞菌、邻单胞菌和弧菌属等也是氧化酶阳性但不是非发酵菌。3.动力，非发酵菌大部分为专性需氧菌，在半固体培养基上观察动力不明显，可用悬滴法或鞭毛染色法检测其动力。（二）假单胞菌属假单胞菌属（Pseudomonas）为严格需氧、有鞭毛、无芽胞、无荚膜的革兰阴性杆菌，氧化酶试验均阳性，是假单胞菌科的代表菌属。1．分类假单胞菌科由假单胞菌属及其亲缘关系密切的菌属（以前大部分属于假单胞菌属）组成，用于假单胞菌科分类的方案有两个，一是根据细菌的表型特征分为7个主要的组，二是根据rRNA-DNA同源研究将假单胞菌科分为5个rRNA群。尽管假单胞菌科的绝大部分细菌原先都被归类于假单胞菌属，但现在只有rRNAⅠ群的细菌属于假单胞菌属（Pseudomonas），包括铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、斯氏假单胞菌、曼多辛假单胞菌、产碱假单胞菌和假产碱假单胞菌7种细菌。rRNAⅡ群的细菌属于伯克菌属（Burkhokderia），包括13个种，其中类鼻疽伯克菌、葱头伯克菌、唐菖蒲伯克菌和皮氏伯克菌与人类疾病相关。鼻疽伯克菌是动物专性寄生菌，在极少数情况下可传播给人（通常通过皮肤的磨损），是本菌属中唯一无动力的种，本属其他菌种与植物有关而与人类疾病无关。rRNAⅢ群的细菌属于丛毛单胞菌科（Comamonadaceae），本科包括两个菌属：丛毛单胞菌属（Comamonas）和食酸菌属（Acidovorax），前者包括土生丛毛单胞菌等三个菌种，后者包括敏捷食酸菌等三个菌种。rRNAⅣ群属于短波单胞菌属（Brevundimonas），包括两个菌种：缺陷短波单胞菌和泡囊短波单胞菌。rRNAⅤ群的细菌属于寡养单胞菌属（Stenotrophomonas），只有一个菌种——嗜麦芽寡养单胞菌。2．细菌特性假单胞菌属是一类无芽胞、有荚膜、散在排列的革兰阴性杆菌，菌体直或微弯、有单鞭毛或丛鞭毛，运动活泼；专性需氧，生长温度范围广，最适生长温度35℃，少数细菌可在4℃或42℃生长，营养要求不高，普通培养基上均可生长；氧化利用葡萄糖，氧化酶、触酶试验阳性，麦康凯上可生长。除曼多辛假单胞菌、产碱假单胞菌和假产碱假单胞菌外，假单胞菌属的细菌在生长过程中可产生各种水溶性色素，主要为黄绿色的绿脓素、青脓素等。3．临床意义人类非发酵菌感染中，假单胞菌占70%~80%，主要为铜绿假单胞菌，其他较为常见的菌种有鲍曼不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、产碱假单胞菌等。4．微生物学检验（1）检验程序见图11-1。医院环境用品、临床标本肉汤培养基分离培养基血平板麦康凯平板可疑菌落OF试验涂片革兰染色O革兰阴性杆菌、氧化酶阳性非发酵菌系列生化反应鉴定到种产绿脓素、青脓素42℃生长、极端单鞭毛乙酰胺酶阳性铜绿假单胞菌图11-1非发酵菌检验程序（2）标本采集根据感染部位不同分别采集痰液、分泌物、尿液以及医院环境用品等。（3）检验方法非发酵菌鉴定较为复杂，应先进行初步分群（属），然后再进行种的鉴定。初步分群的常用实验为葡萄糖氧化发酵试验（O/F试验）、氧化酶试验、动力观察。再进一步作生化试验进行菌种鉴定。4.耐药性假单胞菌属的细菌对有些抗生素天然耐药，临床治疗假单胞菌感染的抗菌药物主要有三类：β内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类。按美国临床实验室标准化委员会（NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards，NCCLS）推荐，非肠杆菌科细菌除铜绿假单胞菌和不动杆菌属外，药敏试验不选用Kirby-Bauer法，应选用肉汤或琼脂稀释法或E-test法。（三）铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）是假单胞菌属的代表菌种，广泛分布于自然界和人体，其在外界环境中存在的重要条件是潮湿环境；为条件致病菌，主要引起医院内感染。1．细菌特性（1）形态染色革兰阴性杆菌，菌体呈球杆状或长丝状，长短不一；单个、呈双或短链状排列；无芽胞，有荚膜，一端有单鞭毛，运动活泼，临床分离株常有菌毛。（2）培养特性专性需氧菌，部分菌株能在兼性厌氧环境中生长，营养要求不高，在普通培养基上生长良好，可生长温度范围是25℃~42℃，最适生长温度35℃，4℃不生长而42℃生长是该菌的鉴别点之一。在血平板、麦康凯平板上均可形成5种不同形态的菌落：①典型型，菌落呈灰绿色，大小不一，扁平湿润，边缘不规则，呈伞状伸展，表面常可见金属光泽；②大肠菌样型，菌落圆形凸起，灰白色半透明，似大肠埃希菌菌落；③黏液型，菌落光滑凸起，呈黏液状；④侏儒型，细小，无光泽半透明菌落；⑤粗糙型，菌落中央凸起，边缘扁平，表面粗糙。在血平板上常可见透明溶血环，有生姜气味；在液体培养基中呈混浊生长，表面可形成菌膜，在SS琼脂平板上，该菌经过24h培养形成较小无色半透明菌落，一般不易与沙门菌和志贺菌菌落相区别，但经48h培养菌落中央呈棕绿色。铜绿假单胞菌在普通琼脂平板上生长时，可产生多种色素，主要为绿脓素（为铜绿假单胞菌特征性色素）和青脓素（荧光素），前者为蓝绿色。从临床标本分离的铜绿假单胞菌约有80%~90%产生绿脓素和青脓素。（3）生化反应氧化酶阳性，在OF培养基上，能氧化利用葡萄糖、木糖产酸，精氨酸双水解酶阳性，乙酰胺酶阳性，液化明胶，利用枸橼酸盐，还原硝酸盐并产生氮气，吲哚阴性。（4）抗原构造铜绿假单胞菌有菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原、黏液（S）抗原和菌毛抗原。O抗原有两种成分：一种是外膜蛋白，为保护性抗原，免疫性强，具有属特异性；另一种为脂多糖（LPS），具有型特异性，可用于细菌分型。（5）抵抗力铜绿假单胞菌对外界因素的抵抗力比其他无芽胞菌强，在潮湿的环境中能长期生存。对干燥、紫外线有抵抗力，但对热抵抗力不强，临床分离菌株对多种抗生素不敏感。2．临床意义铜绿假单胞菌可从医院内许多消毒不严的器皿和溶液中分离出来，常见为水溶液包括洗涤水、消毒液和液体药物等。医院内铜绿假单胞菌所致的肺部感染常见的入侵途径是雾化吸入、氧气吸入，各种侵袭性检查和治疗，如纤维支气管镜、导管、胆道、手术后引流等，破坏了机体皮肤或黏膜屏障，常引起本菌侵袭。严重铜绿假单胞菌感染常发生在局部组织损伤或抵抗力降低的患者，如烧伤病人、各种癌肿患者和应用广谱抗生素、激素、抗肿瘤药及免疫抑制剂等患者；早产、先天畸形儿童和囊性纤维化等疾病及老年患者，也易发生严重的铜绿假单胞菌感染。铜绿假单胞菌的致病作用与多种毒力因子有关，主要有以下几种：（1）黏附和定植形成黏附的条件包括：①铜绿假单胞菌表面的荚膜多糖物质阻止白细胞和吞噬细胞的吞噬作用；②细菌表面的黏附素（主要是菌毛）和上皮细胞上存在的相应受体结合；③宿主防御机制异常。后者使细菌得以驻足，并保持和上皮细胞长时间的接触。完整的皮肤黏膜是天然的屏障，故铜绿假单胞菌很少成为健康人的原发病原菌，但改变或损伤宿主正常的防御机制，如皮肤黏膜破坏、留置导尿管、气管切开插管或免疫机制缺损如粒细胞缺乏、低蛋白血症、各种肿瘤患者、应用激素和广谱抗生素的患者，常可导致感染。烧伤焦痂、婴儿或儿童的皮肤、脐带和肠道、老年人的尿道则是较常见的原发病灶或入侵门户。如果人体抵抗力降低或细菌毒力强，数量多，就可在血中生长繁殖，发生败血症。（2）外毒素A为主要毒力因子，是铜绿假单胞菌产生的最强有力毒素，可抑制蛋白质合成，对皮肤黏膜有坏死作用，约90%菌株产生外毒素A，在烧伤病人，其致死作用特别突出。（3）其他尚有蛋白酶、胞外酶S、溶血素、肠毒素、色素、杀白细胞素、内毒素等。3．微生物学检验（1）检验程序见图11-2。血液、环境用品分泌物、穿刺液、痰、尿、胸腹水等肉汤增菌分离培养直接涂片、革兰染色、镜检（血平板、麦康凯）35℃18～24h初步鉴定最后鉴定革兰阴性杆菌菌落特征色素生化42℃分型氧化酶阳性气味鉴定反应生长（血清学绿脓素噬菌体）葡萄糖OF:O精氨酸水解酶＋乙酰胺酶＋明胶液化＋报告图11-2铜绿假单胞菌检验程序（2）标本采集按疾病和检查目的分别采取不同的临床标本，如伤口分泌物、尿液、脓及穿刺液、血液、脑脊液、胸腹水、关节液等。医院环境检测可从空气、水、物体表面等处采样。（3）.检验方法1）显微镜检查脑脊液、胸腹水离心后取沉淀物涂片，绿色脓汁、分泌物直接涂片革兰染色镜检。为革兰阴性杆菌，有鞭毛。2）分离培养血液和体液标本可先增菌后在转种血琼脂平板和麦康凯平板，脓液、分泌物、中段尿等可直接接种上述培养基。3）鉴定与鉴别根据培养物的菌落特征、产生水溶性绿色色素、特殊的生姜气味、氧化酶试验、OF试验等即可作出初步鉴定。但对色素产生不典型的铜绿假单胞菌还需要做其它生化反应（如明胶液化、精氨酸双水解试验、42℃生长试验等，乙酰胺酶检测试验有一定的价值，）与其他假单胞菌鉴别。从临床标本中分离出铜绿假单胞菌，需要排除污染，从患者血及无菌体液、尿液中分离到本菌，特别是反复检出者，结合临床表现即可确定是感染病原菌，铜绿假单胞菌下呼吸道感染需连续三次痰培养阳性才能确立，如患者无感染的临床表现，虽然分离到铜绿假单胞菌亦应作为正常菌群。（4）耐药性铜绿假单胞菌对多数抗生素不敏感，呈现明显的固有耐药性。长期以来假单胞菌的固有耐药性认为是由于该菌具有外膜的低通透性（主要是外膜微孔蛋白突变，阻止抗生素由外膜进入胞质），最近的研究表明，假单胞菌耐药的产生机制与细菌具有能量依赖性的主动外排系统有关，也可能同时存在其他耐药机制。由于在长期抗生素治疗过程中铜绿假单胞菌可能发生耐药，因此，初代敏感的菌株在治疗3~4周后，测试重复分离株的抗生素敏感性是必要的。目前，对假单胞菌感染多采用联合治疗，如选用一种β内酰胺类抗生素与一种氨基糖苷类或一种喹诺酮类抗菌药物联合治疗严重的铜绿假单胞菌感染。（四）荧光假单胞菌1．细菌特性革兰阴性杆菌，呈单个或成对排列，一端丛毛菌，运动活泼，偶见无鞭毛无动力的菌株。专性需氧，营养要求不高，在普通培养基上可生长，在麦康凯和SS平板上亦可生长，最适生长温度为25℃~30℃，大多数菌株在4℃生长，37℃或42℃不生长。约94%的菌株产生水溶性荧光素（青脓素），在紫外线（360nm）照射下呈黄绿色荧光，有些菌株产生蓝色色素，不扩散。氧化酶阳性，氧化葡萄糖、木糖产酸，对麦芽糖多不分解，水解精氨酸，多能液化明胶，卵磷酯酶阳性。本