抗肿瘤药物评价技术

抗肿瘤药物评价技术抗肿瘤药物药效学指导原则细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则化学药物一般药理学研究技术指导原则中药、天然药物一般药理学研究技术指导原则指导原则体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效••体外实验选用10-15株人癌细胞株，至少重复一次23抗肿瘤药物药效学研究的要求体内、体外实验方法相结合；以体内实验为主1体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验对候选化合物进行初步筛选了解候选化合物的抗瘤谱为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考试验目的体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验试验方法•选用10-15株人癌细胞株•试验还应考察受试物对耐药肿瘤细胞系和正常人源细胞的作用和影响•使用MTT还原法、磺酰罗丹明B(SRB)染色法•药物与细胞共培养时间一般为48-72小时，贴壁细胞需先贴壁24小时后再给药。•试验应设阴性、阳性、溶媒对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药。•试验至少应重复一次四氮唑盐还原法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验试验原理：试验原理：四氮唑四氮唑[MTT,3[MTT,3--(4,5(4,5--dimethylibiazoldimethylibiazol--22--yl)yl)--2,52,5--diphenyldiphenyl--tetrazoliumbromide]tetrazoliumbromide]是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与与NADPNADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTTMTT转化成不溶性的蓝紫转化成不溶性的蓝紫色的甲色的甲[[月替月替](](formazanformazan))，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽(DMSO)(DMSO)溶解甲溶解甲[[月替月替]]后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。可定量测出细胞的存活率。方法要点：受试样品处理细胞结束后，加入方法要点：受试样品处理细胞结束后，加入5mg/mlMTT5mg/mlMTT液液2020微升微升//孔，继续培养四小时。再加三联液并培养过夜。在酶标仪上于孔，继续培养四小时。再加三联液并培养过夜。在酶标仪上于490nm490nm波长处检测波长处检测ODOD值。值。观测指标观测指标直接指标为直接指标为9696孔板上各被测孔的孔板上各被测孔的ODOD值；然后按公式（对值；然后按公式（对照组照组ODOD值值--治疗组治疗组ODOD值）值）//对照组对照组ODOD值值××100%100%计算出相应的细胞生计算出相应的细胞生长抑制率；剧情况可进一步采用长抑制率；剧情况可进一步采用LogitLogit法计算法计算50%50%生长抑制浓度生长抑制浓度IC50IC50值。值。磺酰罗丹明染色法试验原理试验原理：：SRB(sulforhodamineSRB(sulforhodamine是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。水。SRBSRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在515nm515nm波长的波长的ODOD读读数与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。数与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。MTTMTT法的一个缺法的一个缺点是点是ODOD值可随放置时间而变，而值可随放置时间而变，而SRBSRB法无此现象。因此更适用于进行大规法无此现象。因此更适用于进行大规模的试验。模的试验。方法要点方法要点：：用用10%10%冷三氯乙酸与冷三氯乙酸与44℃℃固定已经受试样品处理的细胞固定已经受试样品处理的细胞1h1h，洗，洗涤，干燥；加入涤，干燥；加入4mg/mlSRB4mg/mlSRB液液100100微升微升//孔孔染色染色15min15min，，1%1%冰醋酸洗涤，冰醋酸洗涤，干燥；昀后加入干燥；昀后加入150150微升微升//孔孔的的TrisTris溶液，在酶标仪上与溶液，在酶标仪上与515nm515nm波长处检测波长处检测ODOD值。值。观测指标观测指标同同MTTMTT法。另外，法。另外，NCINCI目前采用以下指标评价化合物的体外抗肿目前采用以下指标评价化合物的体外抗肿瘤活性。测定的瘤活性。测定的ODOD值包括对照组、加药组及加药时的细胞的值包括对照组、加药组及加药时的细胞的ODOD值值CC、、TT、、和和T0T0。据此计算：。据此计算：生长抑制率（生长抑制率（%%））==（（TT－－T0T0））//（（CC——T0T0））××100%100%；；按生长抑制按生长抑制率或细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图，并求出率或细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图，并求出IC50IC50体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验染料排斥法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验试验原理试验原理：活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死：活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞料，一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比例。比例。方法要点方法要点：向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液，昀常用的是：向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液，昀常用的是0.4%0.4%台盼蓝液，混匀，室温染色台盼蓝液，混匀，室温染色55--15min15min，将已染色的细胞悬液滴加至血细胞，将已染色的细胞悬液滴加至血细胞计数板，直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数。计数板，直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数。观测指标观测指标：按（未染色细胞数：按（未染色细胞数//细胞总数）细胞总数）X100%X100%计算活细胞率，对照组活细计算活细胞率，对照组活细胞率应在胞率应在90%90%以上。根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量（以上。根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量（LD50LD50）作）作为药物抗肿瘤活性的指标。为药物抗肿瘤活性的指标。阿拉马蓝法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验试验原理试验原理：非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内的：非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内的NADPHNADPH相相关的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物，采用微培养板自动读数仪在激发关的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物，采用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为与发射波长分别为530nm530nm和和590nm590nm处读取荧光强度值，与活细胞数呈良好的处读取荧光强度值，与活细胞数呈良好的线性关系。线性关系。方法要点方法要点：细胞经受试样品处理后，加入：细胞经受试样品处理后，加入1010--20ul20ul阿拉马蓝染液，继续培养一阿拉马蓝染液，继续培养一定时间，用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为定时间，用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm530nm和和590nm590nm处处读取荧光强度值。读取荧光强度值。观测指标观测指标：根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率，适当时可进一步计算：根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率，适当时可进一步计算IC50IC50值。值。集落形成法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验试验原理试验原理：克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂：克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂66代或代或66代以上时，代以上时，其后代所组成的群体其后代所组成的群体((集落集落))便含便含5050个以上细胞。通过集落计数可对克隆原细胞作个以上细胞。通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，定量分析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被认为是一种较理想的检测方法。日前被认为是一种较理想的检测方法。方法要点方法要点：将浓度为：将浓度为500500个细胞个细胞/ml/ml的对数生长期细胞悬液的对数生长期细胞悬液2ml2ml种至种至35ml35ml的培养的培养皿，并加受试样品适量，培养皿，并加受试样品适量，培养7d7d或更长时间，姬姆萨染色，解剖显微镜下计数或更长时间，姬姆萨染色，解剖显微镜下计数含含5050细胞以上的集落。细胞以上的集落。观测指标观测指标：根据集落数计算集落形成率，对照组集落形成率不应低于：根据集落数计算集落形成率，对照组集落形成率不应低于40%40%，再，再计算用药组的集落形成抑制率，根据情况可进一步采用计算用药组的集落形成抑制率，根据情况可进一步采用LogitLogit法计算受试样品的法计算受试样品的IC50IC50值。值。集落形成率集落形成率==集落数集落数//细胞接种数细胞接种数X100%X100%集落形成抑制率集落形成抑制率==（（11--用药组集落形成率）用药组集落形成率）//对照组集落形成率对照组集落形成率X100%X100%生长曲线测定法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验试验原理试验原理：在昀适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞：在昀适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细数的对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过慢以致停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来生长曲线反映出来。。方法要点方法要点：：将浓度为将浓度为1000010000个细胞个细胞/ml/ml的对数生长期细胞悬液按每瓶的对数生长期细胞悬液按每瓶5ml5ml种至种至25ml25ml的培养瓶，或按每孔的培养瓶，或按每孔100100微升种至微升种至9696孔板，并加受试样品适量，孔板，并加受试样品适量，培养后分别于即刻和培养后分别于即刻和11、、22、、33、、44、、55、、66、、7d7d进行检测。前者可采用台盼进行检测。前者可采用台盼蓝染色计数活细胞，后者可采用蓝染色计数活细胞，后者可采用MTTMTT法或法或SRBSRB法读取法读取ODOD值，并据此进行值，并据此进行作图与计算。作图与计算。观测指标观测指标11、倍增时间、倍增时间(TD),(TD),将实际生在曲线进行直线回归求出将实际生在曲线进行直线回归求出00和和tt时刻时刻的理论细胞数的理论细胞数N0N0和和NtNt，据此计算：，据此计算：TD=0.301t/TD=0.301t/（（logNtlogNt——logN0logN0）；）；22增殖细胞杀伤率（增殖细胞杀伤率（%%））=(N0=(N0——N0N0’’)/N0)/N0××100%100%；；33细胞生长饱和密度细胞生长饱和密度（（NsNs），代表高坪期每毫升细胞数的均数。），代表高坪期每毫升细胞数的均数。体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验白血病（6株）：CCRF-CEM、HL-60、K562、MOLT-4、RPMI-8226、SR肺癌（9株）：A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322、MNCI-H460、NCI-H522乳腺癌：BT-549、HS578T、MCF-7、MCF-7/ADR、MDA-MB-231、ATCC、MDA-MB-435、MDA-N、T-47D卵巢癌：IGROV1、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3肾癌：786-0、A498、ACHN、CAKI-1、RXF-393、SN12C、TK-