第十七章寄生虫病原检查技术

1第五篇实验技术及抗寄生虫药物第十七章寄生虫病原检查技术寄生虫学诊断技术包括病原检查、免疫学检查和分子生物学检查等三个方面。本节将主要对病原检查的各种技术方法作一较全面的介绍第一节粪便检查粪便检查是诊断寄生虫病常用的病原学检测方法。要取得准确的结果，粪便必须新鲜，送检时间一般不宜超过24小时。如检查肠内原虫滋养体，最好立即检查，或暂时保存在35°C～37°C条件下待查。盛粪便的容器须洁净、干燥，并防止污染；粪便不可混入尿液及其它体液等，以免影响检查结果。具体方法如下：（一）直接涂片法（directsmearmethod）用以检查蠕虫卵、原虫的包囊和滋养体。方法简便，连续作3次涂片，可以提高检出率。1．蠕虫卵检查滴一滴生理盐水于洁净的载玻片上，用棉签棍或牙签挑取绿豆大小的粪便块，在生理盐水中涂抹均匀；涂片的厚度2以透过玻片隐约可辨认书上的字迹为宜。一般在低倍镜下检查，如用高倍镜观察，需加盖片。应注意虫卵与粪便中的异物鉴别。虫卵都具有一定形状和大小；卵壳表面光滑整齐，具固有的色泽；卵内含卵细胞或幼虫。2．原虫检查(1)活滋养体检查：涂片应较薄，方法同查蠕虫卵。气温愈接近体温，滋养体的活动愈明显。必要时可用保温台保持温度。（2）包囊的碘液染色检查：直接涂片方法同上，以一滴碘液代替生理盐水，粪便涂抹方法同上。若同时需检查活滋养体，可在玻片另一侧滴一滴生理盐水。同上法涂抹粪便标本，再盖上盖片。片中滴碘液的一侧查包囊；另一侧查活滋养体。碘液配方：碘化钾4g，碘2g，蒸馏水100ml。（3）隐孢子虫卵囊染色检查：目前最佳的方法为金安-酚改良抗酸染色法。其次为金胺酚染色法和改良抗酸染色法。对于新鲜粪便或经10%福尔马林固定保存（4℃1个月内）的含卵囊粪便都可用这三种方法染色。染色过程是先用金胺-酚染色，再用改良抗酸染色法复染。方法步骤如下：金胺－酚（auramine-phenol）染色法：1)染液配制：1g/l金胺—酚染色液（第一液）：金胺0.1g，石炭酸5.0g，蒸馏水100ml；3%盐酸酒精（第二液）：盐酸3ml，95%酒3精100ml；5g/l高锰酸钾液（第三液）：高锰酸钾0.5g，蒸馏水100ml。2）染色步骤：滴加第一液于晾干的粪膜上，10～15分钟后水洗；滴加第二液，1分钟后水洗；滴加第三液，1分钟后水洗，待干；置荧光显微镜检查。低倍荧光镜下，可见卵囊为一圆形小亮点，发出乳白色荧光。高倍镜下卵囊呈乳白或略带绿色，卵囊壁为一薄层，多数卵囊周围深染，中央淡染，呈环状，核深染结构偏位，有些卵囊全部为深染。但有些标本可出现非特异的荧光颗粒，应注意鉴别。改良抗酸（modifiedacid-fastmethod）染色法：1)染色液配制：石炭酸复红染色液（第一液）：碱性复红4g，95%酒精20ml，石炭酸8ml，蒸馏水100ml；10%硫酸溶液（第二液）：纯硫酸10ml，蒸馏水90ml（边搅拌边将硫酸徐徐倾入水中）；20g/l孔雀绿液（第三液）：20g/l孔雀绿原液1ml，蒸馏水10ml。2）染色步骤：滴加第一液于晾干的粪膜上，1.5～10分钟后水洗；滴加第二液，1～10分钟后水洗；滴加第三液，1分钟后水洗，待干；置显微镜下观察。经染色后，卵囊呈玫瑰红色，圆形或椭圆形，背景为绿色。如染色（1.5分钟）和脱色（2分钟）时间短，卵囊内子孢子边界不明显；如染色时间长（5～10分钟）脱色时间需相应延长，子孢子边界明显。卵囊内子孢子均染为玫瑰红色，子孢子呈月牙形，共4个。其他非特4异颗粒则染成蓝黑色，容易与卵囊区分。不具备荧光镜的实验室，亦可用本方法先染色，然后在光镜低、高倍下过筛检查。如发现小红点再用油镜观察的效果好，可提高检出速度和准确性。金胺－酚染色－改良抗酸复染法用本法可克服上述染色法的缺点。具体方法是：先用金胺酚染色后，再用改良抗酸染色法复染。再用光学显微镜观察，卵囊同抗酸染色法所见，但非特异性颗粒被染成兰黑色，两者颜色截然不同，极易鉴别，使检出率和准确性大大提高。（二）厚涂片透明法（改良加藤法）（modifiedKato’sthicksmear）厚涂片透明法适于蠕虫卵检查。取约50mg（已用100目不锈钢筛除去粪渣）粪便，置于载玻片上，覆以浸透甘油—孔雀绿溶液的玻璃纸片，轻压，使粪便铺开（20×25mm）。置于30～36℃温箱中约半小时或25℃约1小时。待粪膜稍干，即可镜检。玻璃纸准备：将玻璃纸剪成22×30mm大小的小片，浸于甘油—孔雀绿溶液（含纯甘油100ml、水100ml和1ml3%孔雀绿水溶液）中至少浸泡24小时，至玻璃纸呈现绿色。使用此法需掌握粪膜的合适厚度和透明的时间，如粪膜厚透明时间短，虫卵难以发现；如透明时间过长则虫卵变形，也不易辨认。如，5检查钩虫卵时，透明时间宜在30分钟以内。(三)浓聚法（concentrationmethod）1.沉淀法（sedimentationmethod）原虫包囊和蠕虫卵的比重大可沉积于水底，有助于提高检出率。但比重较小的钩虫卵和某些原虫包囊则效果较差。(1)重力沉淀法：即自然沉淀法。本法主要用于蠕虫卵检查，蠕虫卵比重大于水，可沉于水底，使虫卵浓集。加之，经水洗后，视野清晰，易于检查。有些虫卵，如钩虫卵，比重较轻，应用此法效果不佳。本法缺点为费时，操作烦琐。取粪便20～30g、加水制成混悬液，用金属筛（40～60孔）或2、3层湿纱布过滤，再加清水冲洗残渣；过滤粪液在容器中静置25分钟，到去上液，重新加满清水，以后每隔15～20分钟换水一次（共3～4次），直至上清液清晰为止。最后倒去上清液，取沉渣作涂片镜检。检查血吸虫卵时，沉淀时间不宜过长，尤在室温高于15C时，卵内毛蚴易孵化。当检查包囊时，换水间隔时间宜延长至约6小时（图17-1）。图17-1粪便自然沉淀法及毛蚴孵化法（2）离心沉淀法（centrifugalsedimentationmethod）：将上述滤去粗渣的粪液离心（1500-2000rpm/min）1～2分钟，倒去上液，6注入清水，再离心沉淀，如此反复沉淀3～4次，直至上液澄清为止，最后倒去上液，取沉渣镜检。本法省时、省力，适用于临床检验。（3）汞碘醛离心沉淀法（merthiolate-iodine-formaldehydecentrifugationsedimentationmethod,MIFC）：本法既可浓集，又可固定和染色，适用于原虫包囊、滋养体及蠕虫卵和幼虫的检查。如准确称取1g粪便，即可作蠕虫卵的定量检查。取粪便1g，加适量（约10ml）汞碘醛液，充分调匀，用2层脱脂纱布过滤，再加入乙醚4ml，摇2分钟，离心（2000rpm/min）1～2分钟，即分成乙醚、粪渣、汞碘醛及沉淀物4层。吸弃上面3层，取沉渣镜检。汞碘醛配制：1)汞醛（MF）液：1/1000硫柳汞酊200ml，甲醛（40%）25ml，甘油50ml，蒸馏水200ml。2）卢戈氏液：碘5g，碘化钾10g，蒸馏水100ml。检查时取汞醛液2.35ml及5%卢戈氏液0.15ml混合备用。但混合液保存8小时后即变质，不应再用；碘液亦不宜于1周后再用。（4）醛醚沉淀法（formalin-ethersedimentation）：取粪便1～2g置于小容器内，加水10～20ml调匀，将粪便混悬液经2层纱布（或100目金属筛网）过滤，离心（200rpm/min）2分钟；倒去上层粪液，保留沉渣，加水10ml混匀，离心2分钟；倒去上液，加10%甲醛7ml。75分钟后加乙醚3ml，塞紧管口并充分摇匀，取下管口塞，离心2分钟；即可见管内自上而下分为4层。取管底沉渣涂片镜检。本法不仅浓集效果好，而且不损伤包囊和虫卵的形态，易于观察和鉴定。对于含脂肪较多的粪便，本法效果优于硫酸锌漂浮法。但对布氏嗜碘阿米巴包囊、贾第虫包囊及微小膜壳绦虫卵等的检查效果较差。2．浮聚法（flotationmethod）利用比重较大的液体，使原虫包囊或蠕虫卵上浮，集中于液体表面，常用的方法有两种：(1)饱和盐水浮聚法（brineflotation）：此法用以检查钩虫卵效果最好，也可用于检查其它线虫卵和微小膜壳绦虫卵。但不适于检查吸虫卵和原虫包囊。用竹签取黄豆粒大小的粪便置于浮聚瓶（高3.5cm，直径约2cm的圆形直筒瓶）中，加入少量饱和盐水调匀，再慢慢加入饱和盐水至液面略高于瓶口，以不溢出为止。此时在瓶口覆盖一载玻片，静置15分钟后，将载玻片提起并迅速翻转，镜检（图17-2）。图17-2饱和盐水浮聚法饱和盐水配制：将食盐徐徐加入盛有沸水的容器内，不断搅动，直至食盐不再溶解为止。8（2）硫酸锌离心浮聚法（zincsulfatecentrifugalflotationmethod）：此法适用于检查原虫包囊、球虫卵囊、线虫卵和微小膜壳绦虫卵。取粪便约1g，加10—15倍的水，充分搅碎，按离心沉淀法过滤，反复离心3—4次，至清水为止，最后倒去上清液，在沉渣中加入比重1.18的硫酸锌液（33%的溶液），调匀后再加硫酸锌溶液至距管口约1cm处，离心1分钟。用金属环钩取表面的粪液置于载玻片上，加碘液一滴（查包囊），镜检。钩取标本时，用金属环轻轻接触液面即可，切勿搅动。离心后应立即取标本镜检，如若放置时间超过1小以上，会因包囊或虫卵变形而影响观察效果。（3）蔗糖离心浮聚法：此法适用于检查粪便中隐孢子虫的卵囊。取粪便约5g，加水15-20ml，以260目尼龙袋或4层纱布过滤。取滤液离心5-10分钟，吸弃上清液，加蔗糖溶液（蔗糖500g，蒸馏水320ml，石炭酸6.5ml）再离心，然后如同饱和盐水浮聚法，取其表面膜镜检（高倍或油镜）。卵囊透明无色，囊壁光滑，内含一小暗点和发出蛋黄色的子孢子。隐孢子虫的卵囊在漂浮液中浮力较大，常紧贴于盖片之下，鉴于1小时后卵囊脱水变形不易辨认，故应立即镜检。也可用饱和硫酸锌溶液或饱和盐水替代蔗糖容液。常见蠕虫卵、包囊的比重见表17—1。9表17－1蠕虫卵、包囊的比重虫卵或包囊比重华支睾吸虫卵1.170－1.190姜片吸虫卵1.190肝片形吸虫卵1.200日本血吸虫卵1.200带绦虫卵1.140微小膜壳绦虫卵1.050钩虫卵1.055－1.080鞭虫卵1.150蛲虫卵1.105－1.115受精蛔虫卵1.110－1.130未受精蛔虫卵1.210－1.230毛圆线虫卵1.115－1.130溶组织内阿米巴包囊1.060－1.070结肠内阿米巴包囊1.070微小内蜒阿米巴包囊1.065－1.070蓝氏贾第鞭毛虫包囊1.040－1.0603．尼龙袋集卵法本法主要用于血吸虫卵的浓集。先将120目/吋（孔径略大于血吸虫卵）的尼龙袋套于260目/吋（孔径略小于血吸虫卵）的尼龙袋内（两袋的底部均不粘合，分别用金属夹夹住）。取粪便30g，放入搪瓷杯内加水捣碎调匀，经60目/吋铜筛滤入内层尼龙袋，然后将两个尼龙袋一起在清水桶内缓慢上下提动洗滤袋内粪液，或在自来水莲蓬头下缓缓冲洗，至袋内流出清水为止。将12010目/吋尼龙袋提出，弃取袋内粪渣，取下260目/吋尼龙袋下端金属夹，将袋内粪渣全部洗入三角量杯内，静置15分钟。倾去上清液，吸沉渣镜检。或将沉渣倒入三角烧瓶内作血吸虫毛蚴孵化。本法有费时短、虫卵丢失少等优点，并可避免在自然沉淀过程中孵出的毛蚴在换水时被倒掉。（四）毛蚴孵化法（miracidiumhatchingmethod）为依据血吸虫卵内的毛蚴在适宜温度的清水中，短时间内可孵出的特性而设计的方法，适用于早期血吸虫病患者的粪便检查。取粪便约30g，先经重力沉淀法浓集处理，将粪便沉渣倒入三角烧瓶内，加清水（城市中须用去氯水）至瓶口，在20～30℃的条件下，经４～６小时后用肉眼或放大镜观察结果。如见水面下有白色点状物作直线来往游动，即是毛蚴。必要时也可以用吸管将毛蚴吸出镜检。如无毛蚴，每隔４～６小时（２４小时内）观察一次。气温高时，毛蚴可在短时间内孵出，因此在夏季要用１.２％食盐水或冰水冲洗粪便，最后一次才改用室温清水（图17-1）。毛蚴促孵法：将用沉淀法处理后的粪便沉渣置于三角瓶内，不加水，或将粪便置于吸水纸上，再放在２０～３０℃温箱中过夜。检查时，加清水，２