紫外分光光度计的应用

紫外分光光度计的应用分光光度法的特点1.灵敏度高2.准确度高3.适用范围广4.操作简便快速、应用范围广吸收光谱的分类远紫外线波长范围：10~200nm分析方法：真空紫外光度法近紫外线波长范围：200~380nm分析方法：紫外光度法可见线波长范围：380~780nm分析方法：比色及可见光度法吸收光谱的分类近红外线波长范围：0.78~2.5um分析方法：近红外光谱法中红外线波长范围：2.5~5.0um分析方法：中红外光谱法远红外线线波长范围：5.0~1000um分析方法：远红外光谱法溶液颜色与光吸收的关系互补色两种颜色的光按适当强度比例混合时，可以形成白光，这两种色光就称为互补色。黄绿青\|/橙——白光——青蓝/|\红紫红蓝溶液颜色与光吸收的关系白光通过溶液时，溶液没有吸收的，该溶液呈无色透明状。白光通过溶液时，溶液全部吸收的，该溶液呈黑色。白光通过溶液时，溶液选择性吸收的，该溶液呈现被吸收波长光的互补色。如：KMnO4溶液，吸绿色而呈紫红色光的吸收曲线将不同波长的光通过一定浓度和厚度的有色溶液，分别测出它们对各种波长的吸光度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标画出曲线，称为光的吸收曲线。光吸收程度最大处的波长称为最大吸收波长。光的吸收定律朗伯-比耳定律光的吸收与溶液的厚度与溶液的浓度成正比。A=kbcA-吸光度b-溶液的厚度c-溶液的浓度k-比吸收系数光的吸收定律透光率透光率用T表示透光率的到数的对数为吸光度A=lg1/T比吸收系数含义入射波长一定时，溶液浓度1%，液层厚度为1cm时的吸光度。光的吸收定律的适用范围各种有色的均匀溶液，一定的浓度范围。超过一定的浓度范围，曲线会发生正偏离或负偏离。偏离的原因1.入射光非单色光2.溶液中的化学反应3.比耳定律的局限性溶液浓度小于0.01mol/L的稀溶液目视比色法工作原理朗伯-比耳定律:A=kbc其中A、k、b相同，c必定相同。优点1.仪器简单，操作简便2.液层较厚，灵敏度较高3.在特定条件下，不符合朗伯-比耳定律的溶液，仍可测定。缺点准确度较差紫外可见分光光度计主要部件光源、单色器、吸收池、检测器、测量系统部分性能721分光光度计波长范围360~800nm玻璃棱镜读数方式：指针式754分光光度计波长范围200~800nm光栅读数方式：指针式紫外可见分光光度计Cary-50分光光度计波长范围190~1100nm光栅读数方式：微机具有扫描功能分光光度计的检验与维护分光光度计的检定周期:一年环境要求1.室温应保持在15~28℃。2.相对湿度应在45~65%,不应超过75%。3.防尘、防震、防电磁干扰。4.防腐蚀。分光光度计的检验与维护保养和维护方法1.不用时不要开光源灯。2.不要拆开单色器，单色器是仪器的核心部分。3.吸收池用后，立即洗净，防止擦伤。4.光电器件应避免强光照射和受潮积尘。5.仪器的工作电压应保持在220v±10%，必要时配备温压器。分光光度法分光光度法两种形式利用物质本身对紫外或可见光的的吸收进行测定生成有色化合物即“显色”以后测定显色反应显色反应分为两类络合反应氧化还原反应其中络合反应是主要的显色反应显色反应的要求选择性好灵敏度高有色化合物的离解常数要小有色化合物组成要恒定显色剂有颜色时，要求有色化合物与显色剂的颜色差别要大，以减小试剂空白显色反应的条件要易于控制显色剂无机显色剂硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢有机显色剂邻菲罗琳、双硫腙、铬天青S等反应条件的选择显色剂的用量显色剂应是过量的，保证显色反应的完全。但是显色剂过量太多，容易引起副反应，造成结果偏差。反应条件的选择溶液的酸度1.溶液的酸度不同，显色化合物的组成和颜色可能不同。2.溶液的酸度变化，显色剂的颜色可能发生变化。3.溶液的酸度过高，降低配合物的稳定性。溶液的酸度过低，会引起金属离子水解。反应条件的选择温度的影响室温进行显色的、加热显色温度对光的吸收和颜色的深浅都有影响显色时间1.立即显色，放置后颜色稳定2.放置一定时间后，进行比色3.立即显色，放置后颜色逐渐褪去反应条件的选择溶剂有机溶剂常会降低有色化合物的离解度，从而提高显色反应的的灵敏度常用溶剂的波长下限（10mm池）水205nm乙醇95%204nm乙晴190nm苯280nm甲醇205nm乙醚215nm氯仿245nm四氯化碳245nm丙酮330nm共存离子的干扰与试剂生成有色化合物干扰离子本身有颜色与试剂反应，生成配合物无颜色，消耗大量显色剂，使被测离子显色反应不完全与被测离子结合成离解度小的另一种化合物，使被测离子与显色剂不反应干扰的消除方法控制溶液酸度加入掩蔽剂利用氧化还原反应改变干扰离子的价态选择适当的参比溶液选择适当的波长采用适当的分离方法除去干扰离子利用导数光谱法、双波长法等新技术参比溶液的选择参比溶液的作用：用于分光光度计的吸光度调零溶剂参比水或有机溶剂试剂参比不加试样的试剂试液参比不加显色剂的试液其他参比试样+掩蔽剂+显色剂+其他试剂测定条件的选择入射光波长的选择入射光波长的选择从灵敏度和选择性两个方面来选择。灵敏度最高应是最大吸收波长选择性最高应是干扰最小的吸收波长测定条件的选择吸光度范围的控制最适宜吸光度范围0.2~0.8透光率为（15%~65%）调节最适宜吸光度的方法1.调节溶液浓度2.使用厚度不同的吸收池定量分析工作曲线法4个以上的浓度，以空白溶液为参比，在选定的波长下，分别测定吸光度，以标准溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵座标，绘制工作曲线。工作曲线为y=a+bxx为标准溶液浓度，y为吸光度，b为直线斜率，a为直线截距，a和b称为回归系数工作曲线法工作曲线的好坏可以用相关系数r来表示相关系数越接近1线形关系越好。一般的光度分析方法r＞0.999曲线强制过原点时曲线演变为y=bx当更换标准溶液、试剂重配时应重新绘制标准工作曲线标准对照法即采用一个标准溶液，与原点构成工作曲线计算公式为c样=A样/A标×c标注意标准样品的吸光度应控制在0.4~0.8以内较好吸收系数法在特定波长，特定液层厚度下，测的样品的吸光度，乘以一定系数即可。如啤酒中双乙酰的测定分光光度法的误差方法误差1.溶液偏离比耳定律2.反应条件的改变仪器误差1.仪器的非理想性引起的误差2.仪器噪声的影响3.反射和散射的影响4.吸收池引起的误差分光光度法的误差