33紫外可见分光光度计1-PPT资料106页

第三节：紫外—可见分光光度计第一部分紫外-可见吸收光谱法的原理第二部分紫外-可见分光光度计构造与类型第三部分紫外-可见分光光度计的应用第四部分紫外-可见吸收光谱分析的条件和影响因素第五部分仪器的使用操作、维护第一部分紫外-可见吸收光谱法的原理一、基本原理:光的选择性吸收分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁，而产生了相应的吸收光谱。属分子吸收光谱。紫外-可见吸收光谱分析是研究物质在紫外-可见光波下的分子吸收光谱的分析方法。紫外-可见区可细分为：（1）10-200nm；远紫外光区（2）200-400nm；近紫外光区（3）400-800nm；可见光区▲可见光：混和光，由波长400～760nm的电磁波按适当强度比例混合而成，因人们视觉可觉查到，故称为可见光。▲紫外光：电磁波的波长小于400nm。▲红外光：电磁波的波长大于760nm。吸光光度法基本理论1、光谱的分类单色光：具有同一波长的光称为单色光。复合光：含有多种波长的光称为复合光。互补光：如果把适当颜色的两种光按一定强度比例混合，可合成白色光，这两种颜色的光称为互补色。2、几种光的性质3、紫外-可见分光光度法概念紫外-可见分光光度法是基于物质分子对200～760nm区域光的选择性吸收而建立起来的分析方法。引入问题：为什么不同的物质呈现不同的颜色？原因由于物质对光的选择性吸收引起的，溶液呈现的是被吸收物质的互补色。KMnO4水溶液呈紫红色，K2Cr2O7水溶液呈橙色。许多物质的溶液本身是无色或浅色的，但它们与某些试剂发生反应后生成有色物质，例如Fe3+与SCN-生成血红色配合物；Fe2+与邻二氮菲生成红色配合物。若把两种适当颜色的光按一定强度比例混合，得到白光，那么这两种光就是互补光，其颜色就是互补色。4、互补光与互补色5、溶液对光的选择性吸收溶液呈现不同的颜色是由于该溶液对光具有选择性吸收。当入射光（白光）全部透过溶液时——溶液无色透明。当入射光（白光）全部被溶液吸收时——溶液黑色。当入射光（白光）通过KMnO4溶液时，该溶液选择性吸收绿色波长的光，而将其它的色光两两互补成白光而通过，只剩下紫红色，未被互补，所以KMnO4呈现紫色。例如：K2CrO4吸收蓝色光，溶液呈黄色CuSO4溶液吸收黄光，呈现蓝色。•物质结构不同•跃迁时吸收和辐射的能量不同•对应的波长不同问题：为什么不同的物体对光具有选择性吸收？•物体的颜色是由于物体对光的选择性吸收的结果。•其颜色就是物体吸收某种光的互补光的颜色。•是透射光的颜色。当一束平行的波长为入的单色光通过一均匀的有色溶液时，光的一部分被容器的表面反射回来，一部分被溶液吸收，一部分则透过溶液。如图所示：6、溶液对光的行为吸收能量守恒定律：I0=Ia+Ir+It由于器皿相同，且反射小，所以Ir0I0=Ia+It通过测量It的大小，求出吸收的光强Ia，It↑，吸收越少，透光强越多。I0入射光的强度Ia被吸收光的强度Ir反射光的强度It透过光的强度T=It∕I0T↑，It↑，吸收↓取值范围：0~1由于T﹤1，所以常用百分透过率，即T%=T×100%透光度（率）T透过光强与入射光强之比透光度吸光度吸光度A—透光率倒数的对数或透光率的负对数。A=lg1/T=-lgIt/I0=lgI0/ItA↑，It↓吸收↑T:0～1A的取值范围：0～∞光的吸收程度与光程长的关系？二、光的吸收定律——朗伯-比尔定律若溶液浓度保持不变，入射光被溶液吸收的多少与溶液液层厚度成正比。A∝L在单色光的条件下，液层厚度保持不变,入射光被溶液吸收的多少，与溶液浓度成正比。A∝C二、光的吸收定律——朗伯-比尔定律当一束平行的单色光通过均匀、非散射性的稀溶液时，溶液对光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比，该式是分光光度法的定量分析依据。朗伯-比尔定律数学表达式：A=KCL二、光的吸收定律——朗伯-比尔定律A=KCL▲朗伯-比耳定律不仅适用于有色溶液，也可适用于其他均匀非散射的吸光物质（包括液体、气体和固体）；▲该定律应用于单色光，既适用于可见光，也适用于红外光和紫外光，是各类吸光光度法的定量依据；▲吸光度具有加和性，是指溶液的总吸光度等于各吸光物质的吸光度之和。吸光度、透光度及浓度的关系：kbcIIT1A0lglgcAc10T摩尔吸光系数k的讨论▲吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数——可作为定性鉴定的参数；▲不随浓度c和光程长度b的改变而改变。温度和波长等条件一定时，k仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；▲同一吸收物质在不同波长下的k值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以kmax表示。kmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。▲kmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。▲k在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。标准曲线法测定未知溶液的浓度时发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。引起这种偏离的因素（两大类）：▲物理性因素：仪器的非理想引起；入射光不是单色光▲化学性因素。只适用浓度小于0.01mol/L的稀溶液偏离朗伯—比耳定律的原因朗—比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液(c10-2mol/L)时才基本符合。当溶液浓度c10－2mol/L时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。吸收光谱曲线（定性分析）将不同波长的光依次通过某一固定浓度和厚度的有色溶液，分别测出它们对各种波长光的吸收程度（用吸光度A表示）。以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，画出曲线，此曲线即称为该物质的光吸收曲线（或吸收光谱曲线）。结论：1、溶液对不同波长的光的吸收程度是不同的，存在最大吸收峰的位置称为最大吸收波长λmax。2、不同物质的吸收曲线，其形状和最大吸收波长都各不相同，可利用吸收曲线来作为物质定性分析的依据。1-c(KMnO4)=1.56×10-4mol·L-12-c(KMnO4)=3.12×10-4mol·L-13-c(KMnO4)=4.68×10-4mol·L-13、不同浓度的溶液，其吸收曲线的形状相似，最大吸收波长也一样。KMnO4光吸收曲线结论：1、在可见光区内，KMnO4溶液对波长为525nm左右的绿色光的吸收程度最大；2、KMnO4溶液入max=525nm；3、浓度不同时，其最大吸收波长不变，但浓度越大，吸收程度（光的吸光度）越大，吸收峰会越高。吸收曲线的作用：选择测定波长开展定性分析判断共存组份对测定有无干扰第二部分紫外—可见分光光度计构造与类型基本构造主要由光源、单色器、吸收池、检测器和显示器五大部分组成。一、紫外-可见分光光度计的基本构造光源单色器样品池检测器显示器▲作用提供激发能,使待测分子产生吸收。提供符合要求的入射光。▲要求能够提供足够强的连续光谱有良好的稳定性、较长的使用寿命,且辐射能量随波长无明显变化。波长范围应能满足分析的需要,紫外波长200～400nm可见400～760nm1、光源1、热辐射光源用于可见光区，如钨灯和碘钨灯；钨丝灯发射波长为350～2500nm连续光谱。最适宜的使用的范围在320～1000nm。2、气体放电光源气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。发射波长为160～500nm的连续光谱。最适宜的使用的范围在185～375nm。▲分类入射狭缝：光源的光由此进入单色器；准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；出射狭缝。2、单色器将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出任意波长单色光的光学系统。▲作用：▲组成：入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光λ1λ2800600500400nm单色器的核心部分是色散元件，起分光的作用。色散元件主要包括：棱镜和光栅棱镜：有玻璃和石英两种材料。色散原理：不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率，而将不同波长的光分开。光栅：是利用光的衍射与干涉作用制成的。一系列等宽、等距离的平行狭缝。由于玻璃可吸收紫外光，玻璃棱镜只能用于400～1000nm的波长范围即只能用于可见光域内。石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185～4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三个光域。可用于紫外、可见及红外光域，且在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。优点：色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优。缺点：各级光谱会重叠而产生干扰。吸收池又叫比色皿：作用：用于盛放待测溶液和决定透光液层厚度的器件。主要有石英吸收池和玻璃吸收池两种。石英吸收池——紫外区须采用λ＞350nm玻璃吸收池——可见区一般用。λ＜350nm3、吸收池主要规格0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm和5.0cm如何鉴别：分别用紫外光测定，若有吸收的为玻璃比色皿注意事项：▲手执两侧的毛面，盛放液体高度四分之三。▲不得将光学面与硬物或脏物接触，先用滤纸吸干水，再用镜头纸或丝绸擦拭。▲含有腐蚀玻璃组分（如：F-,H3PO4等）的溶液，不得长期盛放在比色皿中。▲比色皿使用后应立即用水洗干净。若脏物洗不掉，可用3mol/L盐酸—乙醇（1︰1）溶液浸泡，然后用水洗净。▲不得在火焰或电炉上加热或烘烤比色皿。作用：利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号。常用的检测器有光电池、光电管及光电倍增管。4、检测器（光电转换器）光电倍增管光电池光电管信号显示器以检流计或微安表指示仪表数字显示和自动记录型装置5、信号显示系统(一)按仪器使用波长分类：①真空紫外分光光度计（0.1-200nm）；②可见分光光度计（350-700nm）；③紫外-可见分光光度计（190-1100nm）；④紫外-可见-红外分光光度计（190-2500nm）；（二）按仪器使用的光学系统分类：①单光束分光光度计；②双光束分光光度计③双波长分光光度计④动力学分光光度计二、紫外-可见分光光度计的分类及特点（１）单光束分光光度计经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。样品池参比池（２）双光束分光光度计经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。M1M4参比池样品池M2M3岛津UV-2450（３）双波长分光光度计由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（1和2）的单色光；通过折波器以一定的频率交替通过同一样品池，然后由检测器交替接收信号，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值ΔA。无需参比池。△A就是扣除了背景吸收的吸光度。对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。双波长BECKMAN-DU_640（４）动力学分光光度计解决在光化学反应、辐射化学反应和酶催化反应中，能量转化、酶的降解、生物合成等的反应变化。特点：时间辨别、快速扫描、测定生物化学瞬间产物的吸收光谱和随时间变化值。（三）紫外-可见分光光度计主要技术指标1.波长范围：表示仪器能测定的波长范围。波长范围越大，仪器越好，这与仪器使用的灯有关。2.波长精度：表示仪器单色器波长误差程度。波长误差越小，仪器精度越高，这与仪器