第十三章基因的转录转录后

第十三章基因的转录、转录后第十三章基因的转录、转录后加工及逆转录转录(transcription)是以DNA单链为模板，NTP为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程。与DNA的复制相比，有很多相同或相似之处，亦有其特点，它们之间的异同可简要示于表13-1转录的模板是单链DNA，与复制的模板有较多的不同特点，引出了下列相关概念。转录过程只以基因组DNA中编码RNA（mRNA、tRNA、rRNA及小RNA）的区段为模板。把DNA分子中能转录出RNA的区段，称为结构基因（structuregene）。结构基因的双链中，仅有一股链作为模板转录成RNA，称为模板链(templatestrand)，也称作Watson（W）链(Watsonstrand)、负（-）链(minusstrand)或反意义链(antisensestrand)。与模板链相对应的互补链，其编码区的碱基序列与mRNA的密码序列相同（仅T、U互换），称为编码链(codingstrand)，也称作Crick（C）链（Crickstrand）、正（+）链(plusstrand)，或有意义链(sensestrand)。不同基因的模板链与编码链，在DNA分子上并不是固定在某一股链，这种现象称为不对称转录(asymmetrictranscription)。模板链在相同双链的不同单股时，由于转录方向都从5’→3’，表观上转录方向相反，如图13-1。与DNA复制类似，转录过程在原核生物和真核生物中所需的酶和相关因子有所不同，转录过程及转录后的加工修饰亦有差异。下面的讨论中将分别叙述。参与转录的酶转录酶（transcriptase）是依赖DNA的RNA聚合酶（DNAdependentRNApolymerase，DDRP），亦称为DNA指导的RNA聚合酶（DNAdirectedRNApolymerase），简称为RNA聚合酶（RNApol）。它以DNA为模板催化RNA的合成。原核生物和真核生物的转录酶，均能在模板链的转录起始部位，催化2个游离的NTP形成磷酸二酯键而引发转录的起始，如图13-2所示。因此，转录的起始不需引物，这也是转录与复制在起始阶段的一大区别。一、原核生物的RNA聚合酶细菌中只发现一种RNA聚合酶，能催化mRNA，tRNA和rRNA等的合成，研究得比较清楚的是大肠杆菌（Ecoli）的RNA聚合酶。（一）大肠杆菌RNA聚合酶的组成大肠杆菌RNA聚合酶的分子量约450kDa，由四种5个亚基（α2ββ′σ）组成全酶（holoenzyne），σ亚基与全酶疏松结合，在胞内、外均容易从全酶中解离，解离后的部分（α2ββ′）称为核心酶（coreenzyme）。通过利福霉素等抑制转录的实验研究，对转录酶各亚基的功能已有一定的认识：α亚基可能参与全酶的组装及全酶识别启动子，从而决定哪些基因可转录；β亚基与底物（NTP）及新生RNA链结合；β′亚基与模板DNA结合；β和β′亚基组成酶的活性中心，通过DNA的磷酸基团与核心酶的碱性基团间的非特异性吸附作用，核心酶能与模板DNA非特异性松驰结合；σ亚基的功能是识别启动子，辩认转录起始点，但不能单独与DNA模板结合，当它与核心酶结合时，可引起酶构象的改变，从而改变核心酶与DNA结合的性质，使全酶对转录起始点的亲和力比其他部位高4个数量级，在转录延长阶段，σ亚基与核心酶分离，仅由核心酶参与延长过程。因此，σ亚基实际上被认为是一种转录辅助因子，因而称为σ因子(σfactor)。（二）σ因子生物体在生命周期的不同阶段或在内、外环境有所变化时，其基因表达有一定的时、空顺序，以适应生长、发育及环境变化的需要。RNA聚合酶的活性是决定基因表达的重要一环。而σ因子是RNA聚合酶识别及结合启动子的亚基，原核生物中所有RNA的转录都由同一种RNA聚合酶催化，在生命周期的不同阶段或不同环境下，这个酶如何识别所有转录单位的启动子，是由识别启动子的σ因子来完成的。基因启动子-35和-10区的共有序列（图13-3）是σ因子识别的位点，如表13-2所示，不同的σ因子能识别的共有序列可以完全不同。二、真核生物的RNA聚合酶真核生物的RNA聚合酶已发现有三种，称为RNA聚合酶I、II和III，分别负责转录不同的RNA，它们对特异性抑制剂鹅膏蕈碱的敏感性亦有差异，如表13-3所示。第二节转录过程转录是生物合成RNA的过程，与复制相似，有起始、核苷酸链延长和链合成终止三个阶段。一、转录的起始转录的起始，就是形成转录起始复合物的过程。这一阶段反应所需的辅助因子，在原核生物与真核生物之间有较大的差异。㈠原核生物转录的起始转录的起始由RNA聚合酶与DNA模板的启动子(promoter)结合。经过对百种以上原核生物不同基因的启动子进行分析，发现启动子具有下列的共同点：在-10bp处有一段共有序列（consensussequence），富含AT，即–TATAAT-，系Pribnow等首先发现，因而称为Pribnow盒（box），再往上游-35bp的中心处又有一组保守的共有序列，即-TTGACT-。启动子邻近的结构示如图13-3。结合过程可分为二个步骤，首先由σ因子辨认启动子的–35区，全酶与该区结合，形成疏松的复合物，此时DNA双链未解开，因而称为封闭型转录起始复合物，继而RNA聚合酶移向–10区及转录起始点，在–20区处DNA发生局部解链，形成12～17bp的单链区，RNA聚合酶与DNA结合更紧密，形成开放型转录起始复合物。以单链的模板链为模板，RNA聚合酶上的起始位点和延伸位点被相应的NTP占据，聚合酶的β亚基催化第一个磷酸二酯键的生成，σ亚基从全酶解离，形成DNA-RNA聚合酶（核心酶）结合在一起的起始延伸复合物。㈡真核生物转录的起始真核生物有三种RNA聚合酶，分别催化不同RNA的合成，每种酶都需要一些蛋白质辅助因子，称为转录因子(transcriptionfactor,TF)。为方便讨论，转录因子的命名冠以聚合酶的名称。如RNA聚合酶Ⅱ所需的转录因子称为转录因子Ⅱ（transcriptionfactorⅡ,TFⅡ）。1.RNA聚合酶I催化的转录起始RNA聚合酶I催化前rRNA（40SRNA）的合成。前rRNA基因转录起始点上游有两个顺式作用元件（cisactingelement），一个是跨越起始点的核心元件（coreelement），另一个在–100bp处有上游调控元件（upstreamcontrolelement,UCE）。RNA聚合酶I催化的转录需要2种转录因子，分别称为上游结合因子（upstreambindingfactor,UBF）和选择性因子1（selectivefactor1,SL1）。SL1含有4个亚基，一个是TATA盒结合蛋白（TATA-bindingprotein,TBP），另3个是TBP相关因子（TBP-associatedfactors,TAF）。UBF与DNA结合令模板DNA发生弯曲，使相距上百bp的UCE和核心元件靠拢，接着SL1和polI相继结合到UBF-DNA复合物上，完成起始复合物的组建,开始转录,如图13-4所示。2．RNA聚合酶II催化的转录起始RNA聚合酶II催化各种前体mRNA的合成。研究表明，RNA聚合酶II催化的转录起始需要较多的转录因子参与。为了便于讨论，它们的命名是在转录因子Ⅱ（TFⅡ）后加上大写字母，分别称为TFⅡA~J。RNA聚合酶Ⅱ结合的启动子的特点是，转录起始点上游有三处参与转录调控的保守序列或称为顺式作用元件。在–90bp处有核心序列为GGGCGG的GC盒，–70bp处有共有(consensus)序列为GGC（T）CAATCT的CAAT盒，–30bp处有共有序列为TATAA（T）AAT的TATA盒，又称Hogness盒(Hognessbox)。转录起始点与原核生物相似，大多数为A或G。转录起始复合物的组装：如图13-5。3．RNA聚合酶Ⅲ催化的转录起始RNA聚合酶Ⅲ催化tRNA，5SrRNA和7SrRNA的转录。（1）tRNA基因转录的起始：tRNA基因的转录初产物是tRNA的前体，经加工后产生多个成熟tRNA。在DNA上的调控序列位于起始转录位点的下游，称为内部启动子。有二个调控区，分别位于编码tRNAD-环和Tψ环的序列，分别称为A盒和B盒。如图3-6所示。（2）5SRNA基因转录的起始：5SRNA基因的转录除了需要TFⅢB和TFⅢC外，还需要TFⅢA，首先由TFⅢA结合到起始位点下游81～99bp处（C盒），然后TFⅢC结合到A盒和B盒，继而是类似tRNA的转录，TFⅢB与TFⅢC作用，和聚合酶Ⅲ的结合，即可起始转录。二、转录的延长转录延长阶段发生的反应，在原核生物和真核生物比较相近。总的来说，一是聚合酶如何向转录起始点下游移动，继续指导核苷酸之间磷酸二酯键的形成，二是转录区的模板如何形成局部单链区，便于转录。原核生物RNA聚合酶催化转录起始，即核苷酸链中的第一个磷酸二酯键形成后，σ因子从全酶中解离出来，核心酶就能沿DNA分子移动，真核生物RNA聚合酶不仅需要较多的转录因子来催化起始，而且转录起始后，酶的移动也靠多种转录因子的共同作用使酶的构象发生改变来实现，如在TFⅡH等作用下，聚合酶ⅡC端丝氨酸残基的磷酸化是聚合酶向下游移动的重要因素。在转录延长过程中，DNA双链需解开10～20bp，形成的局部单链区象一个小泡，故形象地称为转录泡（transcriptionbubble）。转录泡是指RNA聚合酶-DNA模板-转录产物RNA结合在一起形成的转录复合物。为了保持局部的转录泡状态，在RNA聚合酶下游的DNA需不断解链，可使其下游的DNA（未解开双链部分）越缠越紧，形成正超螺旋，而其上游DNA变得松驰，产生负超螺旋，需要解旋酶（gyrase）和拓扑异构酶来消除这些现象，如图13-7。转录起始复合物中，核苷酸之间第一个磷酸二酯键的形成是由第一个核苷酸的3’-OH与第二个核苷酸的5’-磷酸之间脱水而成。第一个核苷酸常为G，来自GTP的5’-三磷酸仍保留，第二个核苷酸的3’-OH仍然游离形成5’pppGpN-OH3’。在聚合酶沿模板链的3’→5’移动时，可按模板链碱基序列的指引，相应NTP上的α-磷酸可与延长新链的3’-OH相继形成磷酸二酯键，其β、γ磷酸基脱落生成焦磷酸后迅速水解，释放的能量进一步推动转录，使新合成的RNA链沿着5’→3’方向逐步延长。在转录局部形成的RNA∶DNA杂化双链之间的引力比DNA双链的弱（因为杂化双链间存在dA∶rU配对，dA∶rU的稳定性比dA∶dT的小），延长中的RNA链的5’-端会被重新形成的DNA双链挤出，使合成中的RNA的5’-端游离于转录复合物。三、转录的终止㈠原核生物转录的终止原核生物转录的终止有两种主要机制。一种机制是需要蛋白质因子ρ（Rho）的参与，称为依赖ρ因子(ρfactor)的转录终止机制，另一种机制是在离体系统中观察到，纯化的RNA聚合酶不需要其他蛋白质因子参与，可使转录终止，称为不依赖ρ因子的转录终止机制。1依赖ρ因子的转录终止：ρ因子是一种分子量为46kDa的蛋白质，以六聚体为活性形式。依赖ρ因子的终止位点，未发现有特殊的DNA序列，但ρ因子能与转录中的RNA结合。ρ因子的六聚体被约70～80nt的RNA包绕，激活ρ因子的ATP酶（ATPase）活性，并向RNA的3’端滑动，滑至RNA聚合酶附近时，RNA聚合酶暂停聚合活性，使RNA∶DNA杂化链解链，转录的RNA释放出来而终止转录。如图13-8所示。2．不依赖ρ因子的转录终止：在这种转录终止系统中，模板DNA在终止位点附近有特殊的连续T序列，在连续T之前有富含GC互补区及几个插入碱基，如图13-9。这种互补区的转录物可形成茎-环结构，影响RNA聚合酶的构象使转录暂停；同时，由于转录产物的（rU）n与模板的（dA）n之间的dA∶rU杂交区的双链是最不稳定的双链，使杂化链的稳定性下降，而转录泡模板区的两股DNA容易恢复双链，释出转录产物RNA，使转录终止。㈡真核生物转录的终止真核生物转录