第十二章植物种质资源离体保存

1第十二章植物种质资源离体保存1植物种质资源离体保存的概念和意义保持生物多样性(biodiversity)是一个国际性备受重视的问题。由于生态平衡的破坏，大量物种正在逐渐丧失或毁灭。人工选择及良种的推广，品种构成逐渐单一化，致使许多潜在有益的珍贵种质资源被丢失，而种质资源是植物育种工作的基础，因此，搜集和保存种质资源已受到世界各国的重视。植物种质资源保存的方式有原生境保存(insituconservation)和非原生境保存(exsituconservation)，后者包括移地保存(种质圃或植物园保存)、种质库(种子)保存、离体(试管)保存等。原生境保存和移地保存固然有其明显的重要性，但要保存大量种质，则需耗费巨大的人力、物力和土地，在实际上很难实施，而且易受自然灾害、虫害和病害的侵袭，造成植物种质资源的丧失。这两种方式保存的种质也不利于种质资源的交流。而种子保存又存在以下限制因素：①种子生活力随贮存期的延长会逐渐丧失；②无性繁殖的植物(如香蕉)难于采用种子保存；③采用无性繁殖来保持其优良性状的植物(如许多果树)，用种子繁殖后代会发生变异；④顽拗型种子（根据干燥对种子生命力的影响可将热带种子分为两大类：即顽拗型种子与正统型种子。顽拗型种子不能进行干燥处理，在日常温、湿度条件下干燥也会很快丧失生命力，其种子的含水量通常不能降低到12％以下，否则种子将死亡。这类种子也不能在低温下贮藏。生长在热带的藤黄科、山榄科、龙脑2香科、番荔枝科、无患子科、马钱科等植物都是这类种子）植物不宜用种子保存或保存难度很大；⑤易遭自然灾害袭击而丢失。基于上述原因，从20世纪60年代开始，人们利用细胞和组织培养再生植株的技术，进行了离体保存种质的研究。种质资源的离体保存(germplasmconservationinvitro)是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。在超低温保存中，也经常直接采用植物茎尖或分生组织、胚、花粉等材料作为保存材料。离体种质保存有以下优点：①所占空间少，节省大量的人力、物力和土地；②便于种质资源的交流利用；③需要时，可以用离体培养方法很快大量繁殖；④避免自然灾害引起的种质丢失。当然，离体种质保存也有一些值得注意的不足之处：①对于限制或延缓生长的处理，需定期转移，连续继代培养；②易受微生物污染或发生人为差错；③多次继代培养有可能造成遗传性变异及材料的分化和再生能力的逐渐丧失。70年代以来，人们把冷冻生物学(cryobiology)和植物离体微繁结合起来，发展了离体种质资源冷冻保存(freezingconservationinvitro)或超低温保存(cryopreservation)的技术。随着离体种质保存技术的不断发展和完善，已经或正在建立离体种质保存库。2植物种质资源离体保存的方法2.1限制生长保存限制生长保存利用限制离体培养物的生长速度来保存种质的方3法，是离体种质保存的一种常用策略。限制离体培养物生长速度的方法很多，如低温、提高渗透压、加生长延缓剂(或抑制剂)、干燥、降低氧分压、矿物油覆盖等。这些方法的基本原理类似，即严格控制某种或某几种培养条件，限制培养物(保存材料)的生长，只允许其以极慢的速度生长。这样，转移继代的间隔时间可延长。但应用这些方法时必须注意：①为了降低培养基水分的蒸发速度，要注意贮存容器的类型和密闭方式。②有较大的变异可能性，必须定期对保存材料进行细胞学、遗传学和生产性状的鉴定。2.1.1低温保存法低温保存(lowtemperatureconservation)是限制生长应用最广的方法。一般是在l～9℃(一些热带、亚热带植物在10～20℃)下培养，并经常同时提高培养基的渗透压。在这种条件下，培养物的生长受到限制，继代培养时间间隔数个月至1年以上。这对中、短期种质的贮存是非常合适的。一旦要利用这些种质，只要把培养物转移到常温(正常)下培养，即可迅速恢复生长。2.1.2高渗透压保存法高渗透压保存法就是通过提高培养基的渗透压，达到抑制培养物生长速度的保存方法。这种方法主要是通过影响离体培养物的吸收作用而减缓培养物的生长。一般来说，离体培养物正常生长所使用的培养基蔗糖浓度为2％～4％，提高蔗糖浓度到10％左右，就可达到抑制培养物生长的目的。提高培养基的渗透压还可采用外加甘露醇、山梨醇等惰性物质4(不易被培养物吸收)来提高渗透压，这样可以使其限制离体培养物生长的作用维持更久。一般可用2％～3％蔗糖加2％～5％的甘露醇处理。如在马铃薯外植体的培养基上加入8％蔗糖或3％甘露醇，均可降低培养物生长速度，延长继代培养间隔期。但要注意渗透压太高可能导致培养物死亡。此外，还可以通过增加培养基中琼脂的用量来提高渗透压。2.1.3生长抑制剂(或延缓剂)保存法常规组织培养的培养基中，通常是附加生长素或细胞分裂素，以促进外植体生长与发育。但在离体种质资源保存中，则通常采用添加外源生长抑制剂(或延缓剂)来延缓培养物的生长。最常用的是天然生长抑制剂—ABA，具有抗赤霉素的作用，阻碍RNA聚合酶的活性，抑制DNA合成，从而达到抑制外植体生长的目的。此外，常用的还有青鲜素、矮壮素、二甲氨基琥珀酸酰胺(B9)、多效唑等人工合成的植物生长抑制剂。2.1.4降低氧分压保存法通过降低培养容器内的氧分压，改变培养环境的气体状况，能抑制离体培养物细胞的生理活性，延缓衰老，从而达到离体保存种质的目的，其原理类似于果蔬类的贮藏保鲜方法。如果培养容器内的氧分压太低，则会产生毒害作用。2.1.5干燥保存法水是生命活动的基质，降低培养物水分，其生命活动就能延缓，这与传统的种子干燥贮存类似。如对胡萝卜体细胞胚、愈伤组织进行5脱水处理(将离体材料放在滤纸上，置于空气流动的无菌箱中风干4～7d)，然后置于加生长延缓剂或限制蔗糖的条件下保存。在不含蔗糖而其他条件正常的培养基上可以保存2年。利用限制生长方法进行植物无性系的离体保存，简便易行，材料恢复生长快，适于现代化种质库的管理。值得一提的是，离体保存植物种质时，不同植物、不同基因型或同一品种的不同材料，所采用的保存方法也大不相同。具体采用哪种保存方法，可能与品种的特性和基因型有关。在离体种质保存的实际操作中，通常是把两种或两种以上的保存方法结合使用，更有助于延长不同植物的保存年限。2.2超低温保存2.2.1植物超低温种质保存的概念20世纪70年代，Nay和Street首先证明植物悬浮培养细胞在液氮中保存后能恢复生长，从而导致了种质资源超低温保存法的发展。植物超低温种质保存是指将植物的离体材料包括茎尖(芽)、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方法处理后在超低温(一196℃液氮)条件下进行保存的方法。目前，采用超低温保存植物离体种质获得成功的有草莓茎尖、苹果冬眠芽、香蕉茎尖、猕猴桃茎尖、薯蓣茎尖、马铃薯茎尖、苹果根尖、甘薯茎尖等。2.2.2超低温保存的基本原理将要保存的离体种质经过一定方法进行处理，然后将其保存在液氮中(－196℃)。在液氮中几乎所有的细胞代谢活动、生长都停止了，6因而排除了遗传性状的变异，同时保存了细胞的活力和形态发生潜能。低温冰冻过程中，如果生物细胞内水分结冰，细胞结构就会遭到不可逆的破坏，导致细胞和组织死亡。植物材料在超低温条件下之所以可以长期保存并能在离开保存环境后正常进行细胞分裂和分化，就是在冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分的次生结冰而达到植物材料保存目的。但是，植物细胞含水量比动物细胞高，在冷冻(freezing)过程中，会有冰晶形成和过度脱水，在解冻(thawing)过程中也会重新形成冰晶和遭受温度冲击(thermalshock)，保存难度大。如果直接将保存材料投放到液氮中，细胞和组织由于细胞内水分结冰，引起组织和细胞死亡。因此，植物种质超低温保存必须采取如下措施：①选择细胞内自由水少、抗冻能力强的植物材料；②采取一些预处理措施，提高植物材料的抗冻能力；③在冷冻过程中尽量减少冰晶的形成，避免组织细胞过度脱水；④在解冻过程中避免冰晶的重新形成以及温度冲击导致的渗透冲击(osmoticstress)等。2.2.3超低温保存的基本程序超低温保存有一套比较复杂的技术程序，基本程序包括：植物材料(培养物)的选取、材料的预处理、冷冻处理、冷冻贮存、解冻、再培养等(图12－1)。如果操作不当，保存就会失败，因此，必须掌握好整个技术程序的各个环节。7图12－1植物离体材料超低温保存的基本程序2.2.3.1植物材料(培养物)选取已经研究或应用过的植物材料或培养物主要有三类：①愈伤组织、悬浮细胞、原生质体；②花粉和花粉胚；③茎尖、腋芽原基、胚、幼龄植株。超低温保存离体种质的实际应用中，需综合考虑培养物的再生能力、变异性(材料本身)和抗冻性。选择遗传稳定性好、容易再生和抗冻性强的离体培养物作为保存材料是超低温保存离体种质成功的关键。在早期的离体种质保存研究中，主要用悬浮细胞和愈伤组织为保存材料，建立离体超低温保存的基本技术程序。实际上悬浮细胞和愈伤组织并不是理想的离体种质保存材料，因为它们存在着非常普遍的遗传不稳定现象，在现有的技术条件下，尚无有效的控制措施，并且有些植物的悬浮细胞和愈伤组织经过长期保存，再生能力较差。而采8用茎尖、腋芽原基、胚、幼龄植株等有组织结构的离体材料，由于其遗传稳定性好，易于再生，且细胞体积小、液泡小，含水量较低，细胞质较浓，比含有大液泡的愈伤组织细胞更抗冻，因此是理想的离体保存材料。此外，选择合适生理状态和树龄的材料作为培养物，也是超低温保存应考虑的重要因素。一般来说，小而细胞质浓厚的分生细胞比大而高度液泡化的细胞容易存活。在较大的材料如茎尖、胚或试管苗中，由于高度液泡化的细胞受到严重损伤，冷冻后只有分生细胞能够重新生长。幼小的球形胚比老龄胚存活率高。2.2.3.2材料预处理预处理的目的是使材料适应将遇到的低温条件，提高新分裂细胞的比例。因为新分裂细胞小，胞内自由水含量少，在冷冻过程中细胞内不易有大冰晶形成，细胞不易受害。在实际操作中，往往采取一些措施来提高材料的抗寒能力，从而提高冷冻后材料的存活率和再生能力。常采用的办法是对超低温保存的离体培养物进行低温预处理和加入冷冻防护剂。低温预处理是将离体培养物置于一定的低温环境中，使其接受低温锻炼，提高其抗寒能力。冷冻前或冷冻期间，由于细胞脱水，导致细胞内可溶物的浓度在原生质体中增加，冷冻防护剂可以防止这种毒性的溶解效应。目前常用的冷冻防护剂有甘油、二甲基亚砜(DMSO)、脯氨酸、糖类、聚乙二醇、乙酰胺、糖醇和福美氧化硫等。对植物来说，DMSO是最好的防护剂，用于培养细胞的适宜浓度是5％～8％。9要提高新分裂细胞的比例，可选取具有良好生理状态和合适年龄的植物材料，将其进行预培养，即在合适的固体或液体培养基上培养一段时间，使其细胞达到旺盛的分裂生长状态。对悬浮细胞和愈伤组织来说，加速继代可提高小细胞的频率。这有助于冷冻处理后的存活。此外，将细胞脱水到适当程度，也能显著提高植物材料在冷冻和解冻后的存活率。冷冻前材料预处理的具体方法是：先选取具有良好生理状态和合适年龄的植物材料，将其进行预培养，即在合适的固体或液体培养基上培养一段时间，使其细胞达到旺盛的分裂生长状态。对悬浮细胞和愈伤组织来说，加速继代可提高小细胞的频率。然后，把茎尖或细胞等培养物放在提高蔗糖浓度、添加二甲基亚砜和(或)脯氨酸、温度接近0℃的条件下培养数日。2.2.3.3冷冻处理常采用四种冷冻方法，即慢冻法(slowcoolingmethod)、快冻法(fastcoolingmethod)、预冻法(pre-freezingmethod)和干冻法(dry-freezingmethod)。(1)慢冻法慢冻法应用较为普遍，其特点是投入液氮前先有一个低温的过程。慢冻法是分步进行的，其基本操作为：先以1～5℃／min的速度降温，降至-30～-40℃或-100℃,平衡1h左右，此时细胞内的水分减少到最低限度，再将样品放