第十二章流式细胞仪

流式细胞仪简介第一节流式细胞术流式细胞术(flowcytometry，FCM)是对单个细胞或其他生物微粒(微生物、染色体、人工合成微粒等)进行快速定量分析和分选的--Iq技术。在分析或分选过程中，包在流动液体中处理过的单个细胞或微粒通过聚焦的光源，产生电信号，这些信号代表光散射、荧光、细胞电阻抗等参数，以此测定出细胞或微粒的物理和化学性质，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，以对其进一步培养或分析。包被细胞的液流称为鞘液。所用仪器称为流式细胞仪。流式细胞术综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、免疫学、激光和计算机科学等多门学科和技术，具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点。第二节流式细胞仪一、流式细胞仪的基本结构．流式细胞仪的结构一般可分4部分：激光系统，流动系统，光学和电子系统，数据储存和计算机控制系统，工作原理见图l—1。分选型流式细胞仪的分选工作原理见图1—2。样品(细胞悬液)图1—1流式细胞仪工作原理图2—2分选型流式细胞仪分选工作原理F1PMT：荧光1光电倍增管：荧光2光电倍增管1．流动系统是流式细胞仪的心脏，因为细胞悬液在被检测之前必须首先形成一个很细的稳流，细胞在其内部排成单列通过测量区。细胞悬液和鞘液分别进入流动室，鞘液的作用是使样品悬液中的粒子组成单一纵列方式通过测量区，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。2．激光光源多采用氩离子激光器。使发射光在可见光谱范围内488nm激发。目前市场上大多数荧光色素适用于此波长。激光的单色性好，功率高，稳定。3．光学和电子系统激光束射至经流体力学聚焦的个别细胞和粒子后，光散射在各个方向(3600)发射。有两个光散射参数需收集，前向角散射(FSC)也被称为00散射，检测器位于激光入射的前方，收集与激光照射方向平行的细胞散射光，角度大约在200以下，主要用于检测细胞体积的大小。另一参数为侧向散射(sSc)亦被称为900散射。检测器位于激光入射的侧面，用于检测细胞膜、胞质、核膜等细胞内部结构及胞质内颗粒。荧光信号是由对细胞进行染色的特异性荧光染料受到激光激发后发射的。荧光波长与激光波长不同，而且强度较弱，因此要使用光学滤光片滤除非荧光信号并使用灵敏的检测器。荧光测量时通常使用线性放大器即放大器的输出与输入是线性关系，适用于较小范围内变化的信号如前向角散射和DNA测量。但有时需要对数放大器即输出与输入是对数关系。如果原来输出为1，当输入增加到原来的l0倍时，输出是2。在免疫学检测中常使用对数放大器，因为在免疫学的样品中，可能有的细胞未被染色而仅有自发荧光，为阴性群体；被染上色的细胞特异性荧光可能比自发荧光强数倍到数十倍，为阳性群体。使用对数放大器可以同时分辨出亮度差异大的多个细胞亚群，容易选定不同亚群间的分界点，有利于流式细胞仪的分析和分选。荧光信号的补偿：当用一种激光束同时激发两种染料发射出两种不同波长的荧光时，理论上讲可选择滤光片仅使一种荧光被一个光电倍增管检测。由于目前所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽发射峰值各不相同，但两种荧光发射光谱有一定的重迭，实际上少量不需要的另一种荧光也会被此光电倍增管所检测，导致假阳性结果。可用电补偿功能处理有关光谱重迭，补偿减去不适合荧光通道测定的重迭信号。4．数据贮存和计算机控制系统数据贮存采用列表排队(1istmode)方式。利用计算机用多种图形来表明各参数间的相互关系，以单参数直方图、双参数二维点图、等高图等方式显示。数据分析一般分为设定正确的分析范围，划分计算区域和计算结果。5．细胞分选可使被指定的细胞从细胞群体中分离出来。流式细胞仪所测定的任何参数都可以作为细胞分选器的细胞依据，被选出来的细胞的均一性与所测参数有关。细胞分选的工作原理是把液滴形成信号加在晶体上使之产生机械振动，液柱断裂成一连串均匀的液滴，一部分液滴中包有细胞，如果其特性与被选定要进行分选的细胞特性相符，则带有特定的电荷。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，偏转落入指定的收集器内，完成细胞分类收集的目的。二、流式细胞仪的类型流式细胞仪分为两大类，一类为临床分析型(又名台式机)，特点为仪器光路调节系统固定，自动化程度高，易学易掌握。如BectonDickinson(简称BD)公司的FACSCalibur、BDLSR。BeckmanCoulter公司的EPICSXL，Cytomation公司的MOFL0，Partec公司的Pas，Aber公司的Microcyte，Orth0公司的Cytoron以及BioRad公司的BRYTE—HS等；另一类为科研(分选)型，特点为可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并且将单个或指定个数的细胞分选到特定的培养孑L或板上，同时可选配多种波长类型的激光器，适用于更广泛的科学研究之用。如BD公司的FACSVantage，BeckmanCoulter公司的EPICSAT肌A，Cytomation公司的MOFLOMLS及Partec公司的Pas．m等。三、实例介绍(一)美国BD公司流式细胞仪简介1973年，BD公司与美国Stanford大学合作开发了世界第一台商用流式细胞仪FACSl。BD公司目前的流式细胞仪产品型号主要有FACSCalibur、BDLSR、FACSVantageSE3种。1．FACSCalibur特性(1)双激光立体光路四色荧光分析的完美设计。两个激光器(488nm、635nm)在不同的空间和时间对一个细胞上面标记的4种荧光信号(FLl。FIA)进行激发，488nm激光激发FLl～FL3，635nm激光激发FL4，通过延迟时间的校正保证检测信号来源于同一个细胞。这种设计优点为：减少FL4与FLl一FL3信号之间的重叠，减少补偿，提高检测灵敏度和准确性，以及增加很多不能用488nm激光激发的荧光染料可作为实验的选择，如APC、TOT0一3、TOPR0一3等。(2)检测灵敏度可达到小于750MEsF(moleculeequivalentofsolublefluorochrome)。(3)检测分辨率达到CV值小于2％(注：此CV值是全峰宽Cv，而非半峰宽，反映仪器真正意义上的分辨率)，分辨率直接影响仪器能否分辨细胞内的微小变化。(4)最小检测颗粒0．2p．m，最大检测颗粒50ttrn，基本上大多数的生物颗粒均可检测。