番茄抗叶霉病基因Cf6的RAPD及SCAR标记

中国农业科学2008,41(7):2191-2196ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2008.07.043收稿日期：2007-01-18；接受日期：2007-04-14基金项目：国家“863”项目（202AA207013-5），黑龙江省博士后基金（LBH-Z06146）作者简介：孟凡娟（1975-），女，黑龙江哈尔滨人，研究方向为植物遗传学。Tel：[phone]；E-mail：[e-mail]。通讯作者李景富（1943-），男，黑龙江哈尔滨人，教授，研究方向为植物遗传学。Tel：[phone]；E-mail：[e-mail]番茄抗叶霉病基因Cf6的RAPD及SCAR标记孟凡娟1，许向阳2，李景富2，黄凤兰3（1东北林业大学生命科学学院，哈尔滨150040；2东北农业大学园艺学院，哈尔滨150030；3内蒙古民族大学农学院，内蒙古通辽028300）摘要：【目的】寻找与番茄抗叶霉病基因Cf6连锁的分子标记。【方法】以番茄抗叶霉病和感叶霉病亲本组合（03036×03748）的F2分离群体为研究材料，采用BSA法和RAPD技术筛选与抗病基因连锁的分子标记。【结果】经F2单株分析，在后代群体中扩增出了两条长约500bp的特异片段，该特异标记与叶霉病抗性基因Cf6紧密连锁，遗传距离为8.7cm。测序结果显示，目标片段的大小分别为619bp和559bp，并将该标记转换为SCAR标记。【结论】SCAR标记，可用于番茄叶霉病抗性分子标记辅助育种。关键词：番茄叶霉病；Cf6基因；RAPD；SCARRAPDandSCARMarkersLinkedtoFulviafulvaResistantGeneCf6inTomatoMENGFan-juan1,XUXiang-yang2,LIJing-fu2,HUANGFeng-lan3(1CollegeofLifeSciences,NortheastForestryUniversity,Harbin150040;2CollegeofHorticulture,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030;3CollegeofAgriculture,InnerMongoliaUniversityfortheNationalites,Tongliao028300,InnerMongolia)Abstract:【Objective】ThestudyidentifiedthemolecularmarkerlinkedtoFulviafulvaresistantgeneCf6intomato.【Method】WithaF2populationbetweenaresistantandasusceptibleparent(03036×03748),thelinkedmarkerwasscreenedbyBSAmethodandRAPDtechnology.【Result】Twospecificbandswerefoundatthe500bpregionusingF2-basedbulkedsegregantanalysisplants.AnRAPDmarkerwastightlylinkedtoFulviafulvaresistantgeneCf6intomato,withageneticdistanceof8.7cm,TheRAPDmarkerwasconvertedintoSCARmarker.Sequencingofthefragmentindicatedthatthelengthwas619bpand559bp,respectively.【Conclusion】SCARmarkerscouldbeappliedtoidentifytheresistancetoFulviafulva,andcanbeusedinmolecularmarker-assistedbreedingpractice.Keywords:Fulviafulva;Cf6;RAPD;SCAR0引言【研究意义】番茄叶霉病（FulviafulvaCiferri）是一种世界性病害，在荷兰、法国、加拿大、美国、日本、保加利亚、波兰、前苏联以及中国均有发生，给番茄生产带来了巨大损失[1]。防御番茄叶霉病最有效的方法是培育抗病品种。依靠常规方法耗时、耗力，同时由于人为鉴定标准的差异，会直接影响鉴定结果，延长育种周期。由于番茄叶霉病病菌生理小种分化速度较快，经过较长时间培育的抗病品种很可能在推广时已成为非抗病品种，所以要求育种工作者缩短育种周期。分子标记技术的发展为解决以上问题提供了可能。分子标记可被用于在苗期进行大量的抗病鉴定，不受时间、地域的限制，从而加速育种工作进程。分子标记辅助育种对于提高抗番茄叶霉病新品种选育效率具有重要实际应用价值。【前人研究进展】目前在利用各种分子标记技术寻找与番茄抗病基因连锁的分子标记研究方面已有很多报道。已经筛选到了与番茄根结线虫病[2,3]、番茄白粉病[4,5]、番茄斑萎病[6,7]、番茄烟草花叶病毒病[8,9]、番茄叶霉病[10,11]、番茄晚疫2192中国农业科学41卷病[12]、番茄褐根腐病[13]、番茄茎根腐病[14]、斑诊病[15]、黄萎病[16]、黄化卷叶病毒[17]等抗病基因连锁的分子标记。【本研究切入点】与番茄抗叶霉病基因Cf6连锁的的分子标记研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究拟利用番茄抗叶霉病和感叶霉病亲本组合构成的F2代，筛选出与该抗病基因连锁的分子标记，并将其转化为SCAR标记，提供番茄叶霉病抗性鉴定的分子手段，用于分子标记辅助育种，为该基因的最后克隆奠定基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1植物材料采用抗病材料03036（LA2448，ontario7818）和感病材料03748（不含任何番茄叶霉病抗病基因），以及二者杂交获得的F1代、利用03036以及03748为父本与F1回交获得BC1和BC2两个回交世代和F2代（F1代自交获得）作为试验材料。1.1.2病原材料采用番茄叶霉病病菌主流生理小种1.2.3.4，由东北农业大学番茄课题组提供。1.2试验方法1.2.1接种鉴定及抗、感池建立在4片真叶期喷雾接种，孢子浓度为107·ml-1，接种前、后均保湿24h，温度22～25℃，湿度90%以上，15d后调查发病情况。将发病情况分为抗病和感病两种[18]，具体方法参照李树德的方法[19]如下：0级：无症状；1级：接种叶出现褪绿至黄色病斑；3级：接种叶病斑上产生一薄层稀疏的霉层；5级：接种叶病斑上产生明显的霉层；7级：接种叶病斑上产生浓密的霉层，而且上部叶也受到侵染（仅指整株幼苗接种）；9级：除接种叶病斑上生有浓密的霉层外，上部叶的霉层也很明显（指整株幼苗接种）或病叶开始发黄。其中发病级别为0级、1级、3级为抗病株，5级、7级、9级为感病株。分别从抗病、感病植株中各选取10株，利用Michelmore和Paran提出的BSA法建立抗病池和感病池[20]。为了增强试验的准确性，尽可能减少人为因素造成的误差，在试验中设置了感叶霉病品种作为对照，进行观察鉴定。1.2.2叶片DNA提取DNA的提取采用王关林等[21]提出的方法，稍加改动。1.2.3RAPD体系利用210条随机引物对建立的抗病池和感病池进行扩增。采用20µl的反应体系：2µl反应缓冲液；0.2mmol·L-1dNTPs；1.5mmol·L-1MgCl2；1UTagDNA聚合酶（宝泰克公司）；0.15µmol·L-1引物（210条，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）；20ngDNA模板。反应程序：94℃，5min；94℃，1min；36℃，1min；72℃，5min；35个循环后于72℃延伸10min；4℃，保存。反应在梯度PCR仪9700上进行。扩增产物在1.4%琼脂糖凝胶、120V电压、1×TAE缓冲液中电泳，经EB染色后在紫外灯下观察结果并照相。1.2.4RAPD特异片段的克隆、测序和SCAR引物的设计、扩增利用上海生工UNIQ-5柱离心式DNA胶回收试剂盒回收特异片段，纯化后用pGEM-T-Easy载体连接，测序由上海生工完成。根据测序结果，利用Primer5.0软件设计SCAR特异引物。反应条件为：在20μl反应体系中使用20ng模板DNA，1.5mmol·L-1Mg2+，0.25mmol·L-1dNTPs，1μmol·L-1随机引物，1.0UTaqDNA聚合酶。反应程序为：94℃2min；94℃30s；62℃2min；72℃1min；终延伸72℃4min，共35个循环。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果。同时利用所合成的SCAR引物对亲本及F2分离群体进行扩增验证。1.2.5数据分析利用抗、感池寻找多态条带，再用所有的F2分离后代单株，验证该多态性条带与目标基因连锁程度。利用MAPMAKER3.0软件，并用Kosambi函数将重组率转换成图距单位厘摩（cM）。2结果与分析2.1抗性鉴定进行抗病鉴定的F1代均表现为抗病；184株F2代群体中，其中145株表现抗病，39株表现感病，F2群体抗病与感病株数的分离比为：3.72﹕1.00，进行卡方检测实得χc2=1.45＜χ20.05,2=3.84，符合3﹕1的分离比例，回交的分离比率分别为1.13﹕1.00和1.25﹕1.00，进行卡方检测结果χc2=0.09＜χ20.05,1=3.84和χc2=0.28＜χ20.05,1=3.84，符合1﹕1的分离比例（表1）。从以上的分析结果表明：Cf6基因对番茄叶霉病菌1.2.3.4生理小种的抗性表现为单基因控制的显性性状。χ20.05,1=3.84；P＜0.052.2与Cf6连锁的RAPD分子标记用210条随机引物对抗性亲本、感性亲本、抗病池、感病池进行扩增筛选，其中3个RAPD引物在亲7期孟凡娟等：番茄抗叶霉病基因Cf6的RAPD及SCAR标记2193表1不同世代对番茄叶霉病菌1.2.3.4号生理小种的抗性表现Table1Resistancetorace1.2.3.4ofFulviafulvaindifferentprogenies世代Generation株数No.ofplants实际比例Realityratio理论比例Theoreticalratioχ2抗病株数Resistantplant感病株数Susceptibleplant03748(P1)10003036(P2)010F1(2003年夏)F1(Summer,2003)100F2(2003年冬)F2(Winter,2003)145393.72﹕1.003.00﹕1.001.45BC1(2003年冬)BC1(Winter,2003)26231.13﹕1.001.00﹕1.000.09BC2(2003年冬)BC2(Winter,2003)25201.25﹕1.001.00﹕1.000.28本和抗、感基因池之间扩增表现稳定、可重复。将以上3个引物对184个F2代单株进行RAPD扩增，并进行连锁分析，结果发现，引物S374的多态性产物与Cf6抗性基因具有连锁关系。从图1中可以看出：利用引物S374进行扩增，抗病亲本03036和感病亲本03748分别具有两种特异条带，分别命名为S374-1和S374-2，扩增长度为500bp左右，抗病池同时具有2条特异带，感病池具有1条特异带，所以此标记表现为共显性。其中F1代同时具有这两种带型，F2代具有3种带型，分别为抗病亲本纯合带型（S374-1）、抗病亲本杂合带型（S374-1和S374-2）、感病亲本纯合带型（S374-2）（图2）。统计表明：在145个抗病植株上，137株为有效扩增，8株为无有效扩增；在39株感病植株中，33株无带、6株表现有带，即有14株发生重组（表2）。采用Mapmarker3.0软件对所得RA