疫苗的制备

疫苗如何制备梁静茹罗飞罗亚辉张萌疫苗主要指将病原微生物（细菌、病毒、真菌、立克次氏体、支原体、衣原体等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭火或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫佐剂，例如流感疫苗、乙肝疫苗、霍乱疫苗等。疫苗的产生天花（Smallpox）•由天花病毒引起的一种烈性传染病•天花病毒：呈砖形，能对抗干燥和低温，在痂皮、尘土和被服上可生存数月至一年半之久•临床表现：主要为严重毒血症状、皮肤成批依次出现斑疹、丘疹、疱疹、脓疱，最后结痂、脱痂，遗留痘疤。•传播途径：飞沫吸入或直接接触。•特点：发展迅速，未免疫人群感染后15-20天内致死率高达30％。疫苗的产生天花的防治——中国•宋真宗时期（998-1023年）：人痘法，吸入天花病人痂粉预防天花。•明朝隆庆年间（1567-1572年）：痘衣法、痘浆法、旱痘法和水苗法等多种接种方法出现。•清朝顺治死于天花，得过天花的康熙继位•人痘法的缺点：有时也会引起严重的天花疫苗的产生天花的防治——欧洲•1721年，人痘接种法传入英国•1796年，英国医生E.Jenner利用牛痘防治天花•1798年，医学界正式承认“疫苗接种确实是一种行之有效的免疫方法”。•细胞培养法获得天花病毒——牛痘苗Jenner是牛痘的发明者，但Jenner并不清楚为什么牛痘能够预防天花。1870年，法国科学家Pasteur在对鸡霍乱病的研究中发现，将鸡霍乱弧菌连续培养几代，可以将细菌的毒力降到最低，给鸡接种这种减毒细菌后，可使鸡获得对霍乱的免疫力，从而发明了第一个细菌减毒活疫苗——鸡霍乱疫苗。Pasteur将此归纳为对动物接种什么细菌疫苗就可以使其不受该细菌感染的免疫接种原理，从而奠定了疫苗的理论基础。因此，人们把法国科学家Pasteur称为疫苗之父。疫苗的产生疫苗之父---法国免疫学家LouisPasteur•鸡霍乱弧菌减毒株（第一个细菌减毒活疫苗）疫苗及其技术的发展简史减毒活疫苗制备——第一次疫苗革命基因重组疫苗技术——第二次疫苗革命反向疫苗学技术——第三次疫苗革命减毒活疫苗制备（卡介苗）——第一次疫苗革命Calmette和Guerin将一株从母牛分离到的牛型结核杆菌在含有公牛胆汁的培养基上连续培养230代，经过13年后获得了减毒的卡介苗（BCG），这种菌苗首先使敏感动物豚鼠不再感染结核杆菌。卡介苗于1921年首次给一名新生儿经口服途径进行免疫，婴儿服用疫苗后无任何副反应。这名婴儿在其母亲死于肺结核病后虽与患有结核病的外祖母一起生活，与结核杆菌有密切接触，但是在他的一生中却没有患结核病。由于卡介苗既安全又有效，到了20世纪20年代末，在法国已有5万婴儿服用了卡介苗。此后，卡介苗的使用由口服改成皮内注射。从1928年开始，卡介苗在全世界广泛使用，至今已在182个国家和地区对40多亿的儿童接种了卡介苗。人为处理使病原微生物失去毒力或降低毒力用无毒卡介菌（结核菌）人工接种进行初次感染，经过巨噬细胞的加工处理，将其抗原信息传递给免疫活性细胞，使T细胞分化增殖，形成致敏淋巴细胞，当机体再遇到结核菌感染时，巨噬细胞和致敏淋巴细胞迅速被激活，执行免疫功能，引起特异性免疫反应。基因重组疫苗技术——第二次疫苗革命1986年应用基因工程制备的乙型肝炎表面抗原获得成功，并正式作为乙肝疫苗用于临床，成为最具典型意义的第二次疫苗革命的产物。最初的乙肝疫苗是从乙肝表面抗原阳性的携带者血浆中提取的，这对接种乙肝疫苗的健康人群来讲其危险性是显而易见的。将乙肝表面抗原的基因克隆到酵母菌等真核细胞中，其表达的抗原分子具有和血源疫苗一样的结构和免疫原性。用基因重组制备乙肝疫苗，生产简单、快速、成本低。乙肝基因重组疫苗不仅安全、效果好，而且可以源源不断地供应临床，不必像乙肝血源那样担心阳性血浆的来源和供应问题。基因重组技术研究相关基因和蛋白质产物反向疫苗学技术——第三次疫苗革命2000年6月26日美国Celera公司等宣布人类基因组测序的完成，标志着人类进入了后基因组时代。随着这个时代的到来，生物科学从基因组学到蛋白质组学的新的研究模式已经初步形成，疫苗研究也开始改变过去从表型分析入手的思维方式，而是从全基因水平来筛选具有保护性免疫反应的候选抗原。这种以基因组为基础的疫苗发展策略，有人称之为反向疫苗学。反向疫苗学技术主要包括三个技术步骤：1.基因组信息分析结合基因芯片筛选候选疫苗成分2.高通量基因重组表达候选疫苗蛋白成分3.免疫保护性检测疫苗组成作用原理类型与特点组成疫苗的组成：具有免疫保护性的抗原如蛋白质、多肽、多糖或核糖等与免疫佐剂混合制备而成。抗原是指能刺激机体产生免疫反应的物质。佐剂是指非特异性地增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质，可先与抗原或与抗原一起注入机体。佐剂增强免疫应答的机制是：①通过改变抗原的物理性状，延长抗原在机体内保留时间；②刺激单核巨噬细胞对抗原的递呈能力；③刺激淋巴细胞分化，增加扩大免疫应答的能力。当机体通过注射或口服等途径接种疫苗后，疫苗中的抗原分子就会发挥免疫原性作用，刺激机体免疫系统产生高效价特异性的免疫保护物质，如特异性抗体、免疫细胞及细胞因子等，当机体再次接触到相同病原菌抗原时，机体的免疫系统便会依循其免疫记忆，迅速制造出更多的保护物质来阻断病原菌的入侵，从而使机体获得针对病原体特异性的免疫力，使其免受侵害而得到保护。作用原理类型与特点1.减毒活疫苗2.灭活疫苗3.亚单位疫苗4.联合疫苗5.核酸疫苗6.治疗性疫苗减毒活疫苗通过一定方法使病原体的致病性减弱或丧失后获得的由完整微生物组成的疫苗制品特点：能引发机体感染但不发生临床症状，但其免疫原性可引发机体免疫反应，刺激机体产生特异性的记忆B细胞和记忆T细胞，起到获得长期或终生保护的作用。减毒活疫苗优点：接种次数少，反应小，免疫效果好（体液免疫、细胞免疫、黏膜免疫），成本低缺点：稳定性差，有毒力返祖现象，污染环境，免疫缺陷者不能接种灭活疫苗将病原体经培养增殖、灭活、纯化处理后获得的保留病原体几乎全部组分的疫苗制品。特点：失去了病原体的感染性，但保留了较强的免疫原性和较好的安全性灭活疫苗优点：稳定性好，反应小，免疫缺陷者也可接种缺点：需多次接种，免疫效果较差（体液免疫），需要量大亚单位疫苗利用微生物的某种表面结构成分制成的能诱发机体产生抗体的疫苗制品。分类：1.纯化亚单位疫苗：单个蛋白或寡糖组成、佐剂2.合成肽亚单位疫苗：抗病毒/肿瘤/细菌、寄生虫感染3.基因工程亚单位疫苗类型与特点联合疫苗两种或两种以上抗原物理混合后制成的疫苗制剂。多联疫苗（multi-combinedvaccine）：预防不同病原微生物引起的传染病（例：百白破）多价疫苗（multivalentvaccine）：预防由同一病原微生物不同亚型引起的传染病（例：23价肺炎多糖疫苗）核酸疫苗也称基因疫苗（geneticvaccine），包括DNA疫苗和RNA疫苗。由抗原的编码基因和载体组成，导入机体细胞后可通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原，诱导宿主产生细胞和体液免疫应答的疫苗制剂。治疗性疫苗在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的疫苗制品。最早的治疗性疫苗：狂犬病疫苗疫苗的制备方法灭活全毒疫苗——流感全病毒灭活疫苗减毒活疫苗——皮内注射用卡介苗基因工程重组亚单位疫苗——重组乙型肝炎疫苗生化提取亚单位组分疫苗——吸附破伤风疫苗治疗性疫苗——前列腺癌疫苗Sipuleucel-T疫苗生产的一般流程灭活全毒疫苗——流感全病毒灭活疫苗本品系用世界卫生组织（WHO）推荐的并经国家食品药品监督管理局批准的流感病毒株，分别接种鸡胚，经培养、收获病毒液，病毒灭活、浓缩和纯化后制成。用于预防本株病毒引起的流行性感冒流感病毒甲型流感病毒最容易发生变异（抗原转变、抗原漂移）世界性流感大流行：甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起甲型流感病毒根据H(hemagglutinin，血凝素)和N(neuraminidase，神经氨酸酶)抗原不同分为许多亚型，H有17个亚型（H1～H17），N有10个亚型（N1～N10）。H1、H5、H7亚型为高致病性流感病毒乙型流感病毒（InfluenzaBvirus）抗原变异很慢局限性流行，对人类致病性较低丙型流感病毒（InfluenzaCvirus）抗原稳定致病力较弱，主要侵犯幼儿和免疫力低下的人群，只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染流感全病毒灭活疫苗（一）制备方法1.生产用原材料鸡胚是分离各类病毒的较为理想的材料尿囊腔（1）鸡胚毒种传代和制备：来源于SPF（SpecificpathogenFree）鸡群疫苗生产：来源于封闭式房舍内饲养的健康鸡群、9-11日龄无畸形、血管清晰、活动（2）毒种WHO推荐并提供的甲型和乙型流感病毒株2.毒种种子批的建立及检定符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定2.毒种种子批的建立及检定•建立：以毒种为基础传代（5代以内得成品疫苗）•检定：血凝素型别鉴定试验血凝抑制试验单向免疫扩散试验病毒滴度：鸡胚半数感染剂量法血凝滴度：血凝法无菌检查、支原体检查外源性禽白血病病毒、禽腺病毒检测：ELISA•保存：冻干毒种-20℃以下，液体毒种-60℃以下3.单价原液的制备各流感病毒工作种子批分别接种（尿囊腔），33-35℃培养48-72h病毒收获（尿囊液）收获液检定微生物限度：菌数105CFU/ml，沙门氏菌为阴性血凝滴度收获液合并3.单价原液的制备病毒灭活（甲醛≤200μg/ml）、验证及内毒素含量测定浓缩（超滤）、纯化（柱色谱法、蔗糖密度区带离心）及过滤除菌（硫柳汞）单价原液保存（2-8℃）4.半成品的制备对单价原液根据相同血凝素含量进行配制：15-18μg/剂补加硫柳汞5.成品的制备半成品分批、分装及冻干后包装：0.5-1.0ml/剂，含各型流感病毒株血凝素为15μg/剂（二）检定要求1.单价原液的检定鉴别试验：血凝抑制试验、单向免疫扩散试验病毒灭活验证试验：鸡胚存活率、血凝试验血凝素含量检测：单向免疫扩散试验2.半成品的检定游离甲醛含量≤50μg/剂硫柳汞含量≤50μg/剂血凝素含量：配制量的80%-120%无菌检查3.成品的检定鉴别：单向免疫扩散试验外观：乳白色液体，无异物pH值：6.8-8.0硫柳汞含量≤50μg/剂蛋白质含量≤200μg/剂血凝素含量：配制量的80%-120%卵清蛋白含量≤250ng/剂抗生素残留量≤50ng/剂血凝抑制实验一种测定抗原或抗体的技术血凝现象：有血凝素的病毒能凝集人或动物红细胞血凝抑制试验：血凝现象被相应抗体抑制单向免疫扩散实验将一定量抗体混于琼脂凝胶中制成琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中，抗原扩散过程中与板中抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环沉淀环直径或面积与抗原浓度呈正相关用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即定量检测未知标本的抗原浓度酶联免疫吸附测定将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的反应用于检测特异性抗原和抗体特点：快速、灵敏、简便、载体易于标准化等分类：间接法、夹心法、竞争法间接法ELISA检测——检测抗体用特异性抗原包被固相载体，加入待测的抗体样品反应后，再加入酶标二抗，经底物显色后测定。夹心法ELISA检测——检测大分子抗原用抗体包被固相载体，加入待测的抗原反应后，再加入酶标的第二抗原或抗体，经底物显色后测定，即可计算出待测抗原的量。竞争法ELISA检测——检测小分子抗原用特异性抗体包被固相载体，同时加入酶标抗原和待测抗原的混合物样本，待测抗原将与酶标抗原竞争与固相上抗体结合。经底物显色后测定，计算两组数值之差即可推出待测抗原的量。