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第十八章全自动荧光定量PCR系统的原理和应用引言在过去的15年中,聚合酶链式反应(PCR)已经成为分子生物学研究领域中最重要的方法之一。PCR在基因克隆、测序、mRNA分析、DNA和RNA定量、诱导突变、基因检测、个体鉴定方面的应用都已得到开展，在诊断方面应用尤其广泛。而且自1985年问世后，PCR技术本身有了很大的发展。特别是耐热聚合酶的发现、提高扩增特异性和控制污染方法的应用。由于PCR灵敏度高、特异性好、操作方便，相继一些能够简化PCR产物检测的方案不断问世，这些技术包括微孔板酶联免疫检测法、PCR－连接酶链式反应偶联技术、用色素嵌入进行动态检测分析以及用固定于膜上的探针捕获扩增产物等。虽然生化技术改进使得检测方案有了长足进步，但由于定量PCR要求严格，并且未做到产物检测自动化，从而成为临床医学应用的瓶颈。在1991年至1998年短短的七年间研究开发定量PCR的文献增加了十倍，这是由于定量PCR在灵敏度方面比杂交方法高5倍并具有10倍的动力学范围的优势，使得其成为基因诊断行业的发展趋势。市场上新推出的荧光定量PCR系统如罗氏集团的LightCycler系统，以荧光技术配合超高速的热循环，能在20分钟内完成扩增及分析。突破性PCR技术可使用户在同一管内同时作扩增和检测，在扩增进行的过程中实时地分析样品。对生物医学领域而言,无论是基础研究还是应用方面，PCR都起到了革命性推动作用。在诊断遗传性疾患、检测临床标本中病原体的核酸序列、对法医学标本作遗传学鉴定，以及分析激活癌基因中的突变情况等方面得到广泛应用。在最近三年以来，聚合酶链反应技术在遗传疾病DNA诊断市场占优势，2000年的世界总销售额为3.941亿美元，到2005年可增长到大约6.066亿美元。实时定量PCRPCR反应通常包括反应起始期，对数期（Log期）及平台期。当PCR产物的信号强于系统的背景信号，对数期开始，反应效率降低时进入平台期。对数期的扩增可归结为以下公式：Tn=To(E)nTn表示在循环n时靶序列的数量，To表示靶序列的起始数量，E为扩增效率。扩增效率最大为2（每个循环PCR产物复制一次），最小为1（相对于没有扩增）。对每个PCR反应而言，对数期开始的循环数与起始模板浓度正相关。如果你的PCR起始模板数为106，扩增效率为1.9，根据公式可预测出产生信号时在第14个循环上。如果起始模板数为103，，根据公式可预测出产生信号时在第25个循环上。如果你使用单拷贝的基因扩增，则需要等待36个循环。这就是实时定量PCR的基础。荧光定量系统的工作原理（以LightCycler系统为例）LightCycler温度的循环是通过交替注入系统热室的空气的温度变化而实现，升温是通过加热线圈加热空气进行，降温通过室温空气流动而达到，其温度由热室内的热电偶所控制；以此方法产生的实际温度，相对于已预设的温度只会有±0.3的偏差。热室内另设有一个电扇使其温度均匀分布，确保所有毛细管都有相同的PVR温度；而常规的台式循环仪中导热块内的温度并不均一。由于空气并无有效质量，因此该过程比使用常规台式或水浴式循环仪快得多，温度转变速度可高达每秒20oC，所以在数秒内热室便能达到预设的温度。PCR反应容器为毛细管，由石英玻璃/塑料制成，并工艺性地在管底拉出一个小透镜。塑料部分构成加样腔（最大体积20ul)，玻璃管部分构成反应腔(最大体积40ul)。提供的单盒包装有96个毛细管（Rnasefree)，每个管子上面刻有编号（1－96〕，管盖和管子分开包装。由于使用空气作迅速的热循环，以及毛细管具有很高的表面积/容积比例（确保空气和反应管之间的温度迅速平衡），因此每个PCR循环的时间可降低至低于30秒，在20－30分钟内便可完成整个有30－40个循环的PCR操作。毛细管由玻璃制成且管径均一，所以有合适的光学特性，使管内的荧光散射和衍射减至最低，而荧光在类似光纤的毛细管内有很强的反射集中过程，最后荧光集中在管底的小透镜进行荧光放大。LightCycler仪器有一个光学单元，该单元包含三个检测频道及一个发光二极管（LED)光源。来自LED的兰光(470nm)聚焦在单个的毛细管的尖端，并激发荧光染料发光，产生的荧光在管内反射集中和放大后被引导回光学单元，通过一组光镜和滤光片，能将产生的荧光分成不同的波长，在3个不同的频道记录（频道1：530nm，频道2：640nm，频道3：710nm)。LightCycler系统设定的时间检测，一般是在每一个循环作一次检测，以监测PCR产物形成的水平。在每一频道所检测的荧光讯号立即显示在电脑显示器上，进行实时联线（realtimeandonline)监控。且所有的讯号同时被储存在电脑硬盘中供LightCycler软件分析，不会丢失。LightCycler每次可以扩增32个标本，每一个工作日可进行12次反应，可根据需要灵活进行快速和大量的扩增分析。在热室中固定32个毛细管的是一个卡盘，卡盘嵌顿于一个机械装置内，该机械能将卡盘旋转并可以调整光学单元的位置。对于每一个毛细管，在每一次PCR循环前机械装置都会自动寻找并决定卡盘及光学单元的最佳位置，同样对于每一个循环周期，此位置会以um的精确度重新调整。每一个循环检测32个样品一次，只需5秒钟（包括卡盘旋转，以及卡盘和光学单位的精细定位），每个毛细管的实际检测时间只有20毫秒。样品起始浓度的确定可以通过PCR来实现，在PCR的过程中只有PCR循环的对数期可以真实反映样本的起始浓度。产物数量从以对数形式增加直至PCR效率降低至零仅有几个循环，如果作准确的定量，只能利用这几个循环。以前使用的电泳法只考虑PCR的最终量，很难判别样品的起始浓度。LightCycler具有多种的分析功能，其中一个最重要的的特点市能对PCR的每一个循环逐一监控，这样便能十分准确地鉴别出PCR的对数线性期循环，以便利用此对数线性期确定靶序列的起始浓度，这是PCR对靶序列作准确定量的先决条件。荧光检测模式LightCycler以荧光实时检测的方式分析PCR模板的扩增，可采用的检测方法包括使用DNA双链特异结合的荧光染料（SYBRGreenI)，以及利用基于荧光共振能量转移（FRET）的杂交探针和水解探针（Taqman技术〕及分子信标。1、使用SYBRGreenI监控PCRSYBRGreenI象溴乙啶一样，选择性地和双链DNA结合，并且在结合后产生强烈荧光。在PCR过程中，SYBRGreenI结合到新合成的双链DNA上，荧光信号和DNA含量成正比。检测是在一个循环的延伸期完成后进行的，结果立刻显示在电脑显示屏上。但SYBRGreenI也能和非特异的双链结合，如引物二聚体等；但LightCyler具有特别的功能，能通过熔解曲线分析检出干扰物，并通过在检测时的适当地提高温度，排除这些干扰物的影响。通过检测标准品和样品的荧光曲线，LightCycler能准确计算样品的靶序列浓度。2、使用杂交探针监控PCR杂交探针则应用了两个毗邻的荧光探针去检测特异的PCR产物。第一个探针的3’端标记了荧光供体（FITC），第二个探针位于第一个探针的3’端，它的5’端标记了荧光的受体（LCRed640或LCRed705荧光素〕。当这两个探针的结合在扩增产物上时，两种荧光素能互相接近（间隔1－5个碱基），荧光供体的能量会转移到受体上（即荧光共振能量转移），受体发射出一定波长的荧光，荧光受体发射出的荧光强度与PCR产物的总量成一定的比例。对荧光讯号的检测是在每个循环的退火期进行的。如无靶模板就不会产生讯号；虽然引物二聚体仍可能产生，但不会在此检测模式中被检出。3、使用水解探针模式Taqman探针带有一个荧光发光分子和一个荧光淬灭分子，完整的探针在激光激发下，发光分子所产生的荧光被淬灭分子全部吸收，样品无荧光，而PCR扩增过程中，Taq酶分子在链延长的过程中可以通过自身的5’-3’核酸外切酶降解与模板结合的特异性荧光探针，使得荧光发光分子从探针上切下来而与荧光淬灭分子分开，从而在激光激发下产生特定波长的荧光，这种荧光随着PCR扩增过程而动态增强，定量PCR仪通过全过程动态监测可以得到每一样品中特定模板DNA的启始拷贝数。熔点曲线分析LightCycler具有独特的熔点曲线分析功能，可以鉴别PCR产物、区分特异和非特异扩增产物以及进行突变分析。熔点曲线分析是在扩增循环完成后进行的，从低温缓慢升温至高温，在此过程中每管的荧光被实时检测和观察。当DNA开始变性时，SYBRGreenI染料开始释放，令荧光减少。对于杂交探针模式，随着温度的增加，当其中一个探针熔解，FRET不能进行，从而导致荧光减少。而对于水解探针模式，由于探针在PCR过程中不断降解，探针在熔解过程并不导致荧光强度的变化，不能作熔点曲线分析。熔点曲线分析可用于以下分析：1、区分特异和非特异的PCR产物在PCR过程中，引物二聚体或非特异的PCR产物可能形成，由于他们都是双链的，所以会和SYBRGreenI染料结合。由于非特异DNA的熔解温度（Tm)较低，利用熔解曲线分析，可以将非特异产物和特异产物的讯号区分出来。2、检测单核苷酸多态性及突变通过监控杂交探针和靶序列的熔解行为变化，LightCycler亦能用于突变检测。检测的先决条件是其中一条杂交探针必须横跨要研究的突变。如果靶序列中无突变，杂交便完全配对；如果有突变，不配对的情况会令杂交体的熔解温度下降几度，检测在20分钟内便能完成。多频道检测LightCycler的光学单元能用三个不同频道同时检测来自不同荧光素的荧光。LightCycler的设计适用双光检测，双光检测可在单一样品中检测超过一个靶序列；可使用内对照；使用多个探针配合熔解曲线分析，可研究复杂的突变；可使用内标，使定量准确；进行MultiplexPCR分析。LightCycler的软件LightCycler软件提供全面的PCR参数的设定、样品参数设定以及全面的分析和报告功能。此软件可以让你紧密跟踪PCR反应，并能进行熔点曲线分析，轻易确定产物的熔解温度，迅速区分特异产物和分析突变。日前由罗氏诊断分子生化部研发推出的LC相对定量分析软件（一套效率校正的相对定量的新工具〕，代表了经扩增效率校正的相对定量的研究的重要转折点。全新的LC相对定量软件是独立的一套分析软件，是现有的软件的体系的强有力的补充，极大地延展了LC系统的应用范围。LC相对定量软件是以校正标准品来校准扩增效率，从而对样本核酸浓度进行精确的相对定量。在新概念中突出的一个特征是，认识到管间的扩增效率存在着差异，靶基因、参照基因(比如，管家基因)本身的特性和其他检测因素都有可能造成这种扩增效率的差异。针对这个事实，相对定量软件采用了全新的效率校正的运算法则，适用于此相对定量软件的LC定量检测试剂盒都提供了用于效率校正的系数，来校正试剂盒间和批次间存在的扩增差异。最先采用此相对定量分析模式的试剂盒是LC-HER2/neu定量检测试剂盒和LC-CK20定量检测试剂盒。LC相对定量软件同样适用于用户自行设计的实验体系：用户只需要在每次扩增批次中，加入一系列的特异核酸标准品稀释样同时扩增，通过软件的分析来产生该次扩增检测的校正系数，随后由软件完成用户感兴趣的基因片段的相对定量的分析。LightCycler系统性能LightCycler系统能够达到最高标准性能完全收益于实时PCR技术。重要的因素是动力学范围、灵敏度及系统的重复性。LightCycler有宽广的动力学范围，在同一运行中从10个拷贝到1010个拷贝。灵敏度为在一个基因组当量中检出单拷贝的基因。对于重复性，5000拷贝样品的交叉点的差异系数（CV）为0.3％，10000拷贝样品的CV为0.2％。荧光定量PCR的临床应用1、病原体的定量检测－－传染病治疗过程监测和愈后监控及药效评价。荧光定量PCR可以准确定量出高至1010，低至0个拷贝数的病原体，定量范围极宽，具有重要的临床诊断价值。以乙肝为例，表面抗原强阳性的病人血清中可测得高达每微升105~106的病毒颗粒，随着治疗的进程，病毒拷贝数逐步降低，部分