病原生物实验

病原生物学实验指导实验一显微镜的使用及细菌的观察一、显微镜油镜的使用和保护目的熟练掌握显微镜油镜的使用和保护，以便能娴熟应用油镜观察细菌材料标本。原理细菌个体微小，肉眼不能看到，必须使用油镜，将其放大1000倍左右才能看到。如光线直接从标本玻片经空气层进入油镜头时，由于介质密度不同发生折射现象，因此进入物镜中的光线很少，结果视野暗淡，物像不清晰。如在标本玻片上加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515），就可避免光线的分散，加强视野的亮度，获得清晰的物像（见图1）。材料附有油镜头的普通光学显微镜一架，染色标本片，香柏油，擦镜纸，二甲苯，消毒缸。方法步骤（一）使用法1．油镜的识别油镜头上都有标记，标有90×或100×；镜头前端有黑、白或红色的圆圈：刻有“HI”或“oil”等，其孔径也较其他物镜小，约帽针头大。2．油镜的使用(1)用油镜观察标本时应将显微镜直立，勿将镜臂弯曲，以免镜油流散。(2)以天然光线为光源时，使用平面反光镜，如以灯光为光源，使用凹面反光镜。(3)将聚光器升到最高位置，再将光圈完全打开，增大射入光线的强度。(4)标本固定在载物台上，标本面上加镜油1小滴，用标本移动器夹紧标本。(5)先用低倍镜将视野调至最亮时，并找到标本的适当位置，然后换用油镜。(6)用眼从侧方看着物镜，缓慢转动粗调节器，使物镜头浸于油滴内，并几乎与玻片接触为止，但切勿使两者相碰，防止损伤镜头或压碎玻片；然后从目镜观察，轻轻转动粗调节器，看到物像时，再调换细调节器，使物像清晰。未能看到物像时，再重复上述操作。(7)油镜头使用后立即用拭镜纸擦净镜头上的油。如油已干，可在试镜纸上滴少许二甲苯擦试，并随即用干的试镜纸擦去二甲苯，以防镜片脱落。（二）油镜的保护1．显微镜是贵重精密仪器，使用时要精心爱护，不得随意拆散和碰撞。2．取送显微镜时，应右手持镜臂，左手托镜座，平端于胸前，然后轻放于台面上或柜箱内。3．防止与强酸、强碱、乙醚、氯仿、酒精等化学药品接触。4．擦镜头时，用试镜纸擦，切忌使用粗糙的纸片或布片擦试等。擦镜时应顺其直径方向擦，不要转圈擦。5．不用时，将物镜转开呈八字，使其不正对聚光器，以免物镜与聚光器相碰撞。将聚光器下降，罩上镜套或盖布，对号归位。思考题1．怎样操作才能使显微镜的视野最亮？标本最清晰？2．使用油镜应注意哪些主要事项？二、细菌材料玻片标本制备（操作）目的细菌材料需涂布固定于玻片上，然后经染色才能观察其形态、结构及染色反应。原理细菌为胶体原浆蛋白为主，涂布在玻片上经火焰温热后可固定于玻片，再经染色冲洗既可被染上颜色，且不易被水冲洗掉。材料葡萄球菌、大肠杆菌培养物、玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、火柴、消毒缸。方法步骤按涂片→干燥→固定顺序进行。1．涂片取洁净载玻片1张，用接种环取1~2环生理盐水置于玻片，接种环灭菌后取菌少许，与盐水混匀并涂成面积不超过1cm2的薄膜。如用液体培养物涂片，可直接取培养物涂于玻片上，不加生理盐水。2．干燥将涂片放空气中自然干燥，或将标本面向上，放在离火焰较远处烘干，避免烤焦。3．固定手持载玻片一端，将涂片在火焰高处连续通过3次，约2～3秒，就可固定标本。注意事项1．玻片要洁净无油，否则菌液不易涂开。不宜选用厚玻片，以免标本观察时视野难调清晰。2．取菌量宜少，涂上要均而薄3．水洗时要以细流水徐缓冲洗，避免直接冲洗涂菌处，要切忌未经火焰固定的标本立即染色水洗。思考题涂片后为什么必须进行固定？固定时应注意什么？三、细菌的革兰染色法（操作）目的革兰染色法是最常用的细菌鉴别染色法，根据染色结果将细菌分成两大类，即革兰阳性菌和革兰阴性菌，此有助于细菌鉴别、分析细菌的结构特点、致病性和选用抗菌药物提供依据。原理由于两大类细菌细胞壁成分和结构不同。革兰阴性菌细胞壁中有较多的类脂质，而肽聚糖含量较少。当用酒精脱色时，溶解了类脂质，增加了细胞的渗透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞脱色，经复染后，染上复染液的颜色。而革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量多且交联度大，类脂质含量少，经酒精脱色后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，细胞仍保留结晶紫的颜色。材料1．葡萄球菌和大肠杆菌18～24小时培养后的混合菌液。2．革兰染色液一套。3．其它材料同玻片标本制备法。方法步骤涂片→干燥→固定后按以下顺序染色。1．初染滴加结晶紫染液数滴于标本面上，染色1分钟，轻轻水洗，甩干。2．媒染滴加卢戈氏碘液数滴于标本面上，染色1分钟，轻轻水洗，甩干。3．脱色滴加95%酒精于标本面上，频频倾动玻片，直到不再溶下染料为止，约半分钟，视标本片材料厚薄而增减时间，然后水洗、甩干。4．复染加稀释石炭酸复红液于标本面上，染1/2～1分钟，水洗后甩干，用毛边纸或滤纸轻轻吸干，待标本充分干燥后加油，用油镜观察并绘图。提示：经革兰染色后，显紫色者为革兰阳性菌，显红色者为革兰阴性菌。注意事项1．注意掌握好染色的时间，尤其是酒精脱色时间，不宜过长或过短。2．染色过程中，不可使染液干涸。3．选用适龄培养物，以18～24小时为宜，否则影响染色效果。4．细菌染色标本片观察后仍应放入规定的玻片缸中以便消毒处理。思考题1．革兰染色法的基本步骤如何？应注意哪些关键步骤？2．革兰染色有何实际意义？四、细菌的基本形态和特殊结构观察（示教）目的在适宜条件下，各种细菌保持其原有形态和染色反应，可作为菌种鉴别基本条件。某些细菌除了具有菌细胞的基本结构之处，尚具有某些特殊结构，可供菌种的鉴别。原理细菌为无色半透明胶体，经染色或特殊染色后，可显示其固有形态或特殊结构，可以供菌种的观察和识别。材料1．细菌基本形态标本片(1)球菌葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、脑膜炎双球菌染色标本片。(2)杆菌大肠杆菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等染色标本片。(3)螺菌类霍乱弧菌、幽门弯曲菌标本片等。2．细菌特殊结构标本片肺炎球菌荚膜、破伤风杆菌芽胞、变形杆菌鞭毛等染色片。方法步骤1．使用油镜观察细菌基本形态各标本片并绘图。2．在示教油镜下观察细菌特殊结构标本片并绘图。思考题1．细菌有哪些特殊结构，其在医学实践中意义如何？2．为什么细菌能保持其固有形态？实验二病原性球菌、杆菌一、观察各病原性球菌的菌落特征（示教）目的熟悉病原性球菌的培养特性及主要鉴别点材料与方法金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌血琼脂平板、脑膜炎双球菌巧克力平板培养物。观察各菌生长情况，注意单个菌落的形态、大小、表面、边缘、透明度、颜色及溶血环。思考题和溶血的实质是什么？二、血浆凝固酶试验-玻片法（操作）目的掌握血浆凝固酶试验的原理。原理致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使人或动物血浆发生凝固，因此，测定血浆凝固酶的有无是鉴定葡萄球菌致病性的重要依据。致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶，一种是结合凝固酶，结合在细胞壁上，使血浆中的纤维蛋白原变成纤维蛋白而附于细胞表面，发生凝集，可用玻片法测出。另一种是分泌至菌体外的游离凝固酶，作用类似凝血酶原物质，可被血浆中的协同因子激活变成凝血酶样物质，而使纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而使血浆凝固，可用试管法测出。材料金黄色葡萄球菌培养物、表皮葡萄球菌培养物、玻片、生理盐水、兔血浆、接种环、酒精灯、火柴、消毒缸方法1．取干净玻片一张，用记号笔将玻片划成三格，其中第一格、第二格各加2接种环的兔血浆，第三格加2接种环生理盐水。2．用接种环取少许金黄色葡萄球菌培养物分别于第一格的兔血浆及第三格的生理盐水混匀，取少许表皮葡萄球菌培养物与第二格的兔血浆混匀。3．5分钟以内观察结果。结果若有凝块出现，即为阳性；若无凝块出现，则为阴性。思考题致病性葡萄球菌的特点有哪些？鉴定致病性葡萄球菌常用的方法有哪些？三、肠道杆菌在选择鉴别培养基上的菌落特点（示教）选择鉴别培养基中除基本营养成分外，含乳糖、指示剂、选择性抑菌剂等成分。如SS琼脂培养基中指示剂为中性红，选择性抑菌剂为胆盐、枸橼酸钠和煌绿等，对大肠杆菌有抑制作用而对肠道病原性杆菌无抑制作用或作用微弱。大肠杆菌在SS平板上生长受抑制，少数长出菌落者因发酵乳糖产生酸类，能使中性红变红，以致菌落呈红色，而一般肠道致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨产生硷性物质，故菌落呈淡黄色，故起到选择鉴别大肠杆菌及其他肠道致病菌的作用。EMB培养基中伊红、美蓝兼有指示剂和选择性抑菌剂的作用，大肠杆菌在EMB平板上因分解乳糖产酸，pH下降，使菌体带正电荷，从而结合伊红、美蓝使呈紫黑色有金属光泽的菌落，而一般肠道致病菌不分解乳糖、呈无色半透明菌落。SS琼脂培养基对大肠杆菌抑制作用很强，EMB琼脂培养基对大肠杆菌抑制作用较弱，故前者更适宜于沙门菌、志贺菌等肠道病原性杆菌的分离培养。表肠道杆菌在SS平板、EMB平板上的菌落特征培养基大肠杆菌菌落沙门菌、志贺菌等菌落SS平板红色较小、淡黄色半透明EMB平板紫黑色、有金属光泽较小，无色半透明四、肠道杆菌的生化反应及动力（示教）材料5种肠道杆菌在葡萄糖发酵管、克氏双糖铁培养基、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基的24小时培养物。结果观察1．观察葡萄糖发酵管内5种肠道杆菌的生长情况，注意是否产酸或产酸产气。2．观察克氏双糖铁培养基内5种肠道杆菌生长情况，注意对葡萄糖及乳糖分解能力、能否产气；有无硫化氢产生。3．观察能否分解尿素，如能分解尿素形成NH4OH呈硷性，可使培养基（含指标剂酚红）变为桃红色。4．在蛋白胨水培养物中滴加数滴吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛），如能分解色氨酸产生吲哚，则出现玫瑰红色环，即为吲哚试验阳性。5．观察细菌在半固体培养基中生长情况，如细菌仅沿穿刺线生长，为动力试验阴性，如扩散生长而使整个培养基混浊，则为动力试验阳性。表5种肠道杆菌的生化反应及动力试验菌名生化反应动力葡萄糖乳糖H2S尿素靛基质大肠杆菌○+○+－－＋＋变形杆菌○+－＋＋＋／－＋乙型副伤寒杆菌○+－++－－＋伤寒杆菌＋－＋／－－－＋痢疾杆菌＋－－－＋／－－思考题什么叫选择鉴别培养基？举例说明。实验三病毒及其它微生物一、钩端螺旋体（示教）材料钩端螺旋体镀银染色示教片方法用油镜观察钩端螺旋体的形态、染色特点二、狂犬病病毒包涵体（示教）材料狂犬病病毒包涵体HE染色示教片方法用油镜观察狂犬病病毒包涵体的特征，在神经细胞的胞浆内可见嗜酸性包涵体，至圆形或椭圆形，数量1个或多个。三、病毒的血凝抑制试验（示教）原理病毒的红细胞凝集现象，可于病毒（或其血凝素）悬液中，加入特异性免疫血清所抑制，即为病毒的红细胞凝集抑制试验。方法按下表进行塑料板孔123456789血清对照10抗原对照11血球对照生理盐水(ml)－0.250.250.250.250.250.250.250.250.250.25病人血清(ml)1:10稀释0.250.250.250.250.250.250.250.250.25弃0.2500病毒抗原(ml)0.250.250.250.250.250.250.250.2500.2500.5%鸡红细胞(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5摇匀，室温中静置30～60分钟结果血清稀释度1:101:201:401:801:601:3201:6401:1280///结果判定以能完全阻断病毒抗原发生血凝的最高血清稀释度为该血清的血凝抑制效价。思考题1．内基小体的概念。2．病毒的血凝抑制试验原理。