第十四章试验研究

第十四章试验研究在在进进行行环环境境与与健健康康关关系系研研究究时时，，不不仅仅需需要要宏宏观观的的流流行行病病学学研研究究，，微微观观的的试试验验研研究究手手段段也也是是不不可可或或缺缺的的。。试试验验研研究究从从很很大大程程度度上上弥弥补补了了流流行行病病学学方方法法的的局局限限性性，，如如：：可可根根据据研研究究目目的的和和要要求求，，人人为为控控制制暴暴露露水水平平和和强强度度，，避避免免人人群群调调查查中中存存在在的的众众多多干干扰扰因因素素；；能能利利用用实实验验动动物物的的任任何何组组织织和和器器官官，，从从整整体体动动物物到到分分子子水水平平观观察察各各种种效效应应，，观观察察指指标标不不受受限限制制，，能能更更准准确确地地了了解解体体内内作作用用的的靶靶和和毒毒作作用用机机制制；；可可利利用用特特殊殊基基因因型型的的细细胞胞、、转转基基因因动动物物等等试试验验材材料料，，引引入入相相关关学学科科的的新新技技术术，，更更有有利利于于研研究究的的深深入入。。第第一一节节试试验验研研究究的的基基本本内内容容和和任任务务在在环环境境因因素素对对健健康康影影响响的的研研究究中中，，环环境境毒毒理理学学是是有有用用的的试试验验研研究究手手段段，，它它的的研研究究内内容容和和任任务务主主要要是是：：11、、对对未未知知毒毒性性效效应应的的环环境境因因素素，，研研究究其其毒毒性性作作用用大大小小、、蓄蓄积积性性、、作作用用的的靶靶器器官官和和组组织织等等基基本本毒毒理理学学特特征征，，以以及及对对其其致致畸畸、、致致癌癌、、致致突突变变性性的的特特殊殊毒毒性性作作用用作作出出评评价价；；22、、对对特特定定的的环环境境因因素素，，研研究究其其剂剂量量--反反应应关关系系，，为为卫卫生生基基准准的的制制订订及及环环境境危危险险度度评评价价提提供供依依据据；；33、、毒毒作作用用机机制制研研究究，，探探索索环环境境因因素素在在机机体体反反应应中中出出现现的的特特异异的的、、敏敏感感的的指指标标，，即即生生物物标标志志，，为为环环境境流流行行病病学学调调查查提提供供新新的的手手段段；；44、、对对已已造造成成健健康康危危害害，，并并通通过过环环境境流流行行病病学学调调查查出出的的可可以以致致病病因因素素，，建建立立动动物物模模型型予予以以证证实实，，确确定定病病因因；；55、、应应用用于于环环境境生生物物监监测测一一、、急急性性毒毒性性试试验验的的目目的的：：概念：研究化学物大剂量一次染毒或24小时内多次染毒动物后所引起的毒作用试验。主要根据人体可能的暴露途径，选择经口、经皮、经呼吸道的染毒途径进行急性毒性试验，获得LD50或LC50。农药等有可能与皮肤或眼接触的化学物需进行皮肤刺激试验、眼刺激试验和皮肤变态反应试验。对呼吸道有刺激作用的化学物还应进行吸入刺激阈浓度试验。通过急性毒性试验，可对化学物的毒性作出初步的估计并确定其急性毒作用特征，为急性毒性定级、进一步试验的剂量设计和毒性判定指标的选择提供依据。目的：在短期内了解该物质的毒性大小和特点，并为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。1、确定供试化学物急性毒性的剂量—反应关系和中毒特征；2、求LD50或LE50,为急性毒性评价提供依据。3、研究毒物的毒动学和毒效学过程。用来表示急性毒性大小的是LD50:对受试物的个体感受性影响较小，有更高的重现性；从剂量反应曲线上看它处于曲线的中段，是死亡率对剂量敏感的部位，有60％一70％死亡动物集中在LD50附近。见p505表22-5，22-6二、试验程序与评价1．动物选择首先选择受试物在体内代谢情况与人体内相近的或对受试物最敏感的品系。啮齿类：大鼠、小鼠；兔、猪、狗。应对两种性别、成年和幼年动物进行测定。2．染毒途径与方式：一般应与人的接触途径相同。常用的有以下几种：(1)经口染毒常用灌胃法，也可将受试物放在饮水中由动物自由摄取。将化学物与饲料混和．具有剂量不准确的缺点，而且常会影响吸收，降低化学物的毒性。为了便于染毒常需用溶剂来溶解受试物或将其配成混悬液，溶剂本身应无毒，且不与受试物起反应。溜胃容积一般大鼠不超过3m1，小鼠不超过o．5m1，当染毒剂量过大时，可分几次给药。(2)经呼吸道染毒将实验动物放在有毒气或粉尘的染毒柜内进行染毒。急性吸入染毒采用静式染毒瓶(20—25L)或染毒拒(25—50L)，加入定量受试物形成所需浓度的空气环境，让动物自由吸入，染毒2—4h。(3)经皮肤染毒本法主要用于化学物如化妆品农药经皮(或粘膜)吸收所引起的急性毒性。常用动物是成年家免或脉鼠，有时也用大鼠和小鼠。在正式给药前24h，给动物背部脱毛，注意勿伤皮肤。将受试物均匀涂布于皮肤表面，用纱布覆盖，共敷24h。3．试验程序：（1）剂量与分组首先应根据受试物的结构对比文献中类似化学物的致死量作初步估计，然后进行预试以找出粗略的LD50或LD0。正式试验可在LD100与LD0之间设5—7个剂量组。（2）症状观察时间：24h或两周内的反应。观察内容：表现症状和解剖观察p504表22-4三、LD50的计算与结果评价计算LD50及其标准误的方法：.通常采用概率单位法和寇氏法。见p506。根据所得结果，按前述急性毒性分级标准，评定其毒性大小。LD50值愈小，毒性愈大。各种化学物之间的毒性有明显的差异。概率单位法用正态曲线下的面积来表示死亡率的大小，其均数左右边的面积各为50%。将正态曲线横轴上的单位，用标准正态差为单位来计算：d=(x-μ)/δ为消去负号，将其值一律加5，称为概率单位。死亡率为50%时，概率单位为5，以此类推。从表17-1百分率-概率单位换算表，可以任一死亡率换算为相应的概率单位。经此换算，剂量对数与概率单位(即表示死亡率)，已不是S状曲线(A)而成为直线关系(B)。LC50计算步骤如下：a．根据各组死亡率从表17-1百分率-概率单位换算表中查到各组的概率单位，如第一组死亡率为80％，查得概率单位为5.84，余此类推。死亡率为100％或0％者，不列入计算。b用方格纸绘相关线，横轴表示浓度对数（x），纵轴表示概率单位（y），各级数值点在图上（图17－7）。C．顺着各点的分布趋势，用直尺绘出一条最适合于各点的直线，此线应尽量靠近概率单位为5及附近的点子。画线前可用透明尺或用一根黑线进行测试，为直线通过各点中间。d．求概率单位与处的浓度对数（m），其反对数即为LC50e.剂量-反应关系的回归方程的计算：可选两个相距较远的概率单位点y□和y2,求回归系数b。代入回归方程式中：计值为任一组概率单位的估yˆ5为概率单位yb为直线斜率x为y的剂量对数x为概率单位5的剂量对数f.求LC50的可信限先求LC50的标准误差(Sm)：=4平均致死量法（又名寇氏法）此法计算LD50较为简便，但试验时要符合下列要求：①每个试验组动物数要相同；②各组剂量要按等比级数分组；③最大剂量的死亡率最好为100％或与之接近，最小剂量的死亡率最好为0％或与之接近。计算公式如下：式中，Xm为最大剂量的对数值；i为相邻剂量比值的对数；p为各组死亡率的总和（以小数表示）。例小鼠腹腔注射致百虫急性毒性试验结果如表17－4所示，求LD50式中，p为一个组死亡率；q为一个组存活率；i为相邻剂量比值的对数；h为各组动物数。第二节亚慢性和慢性毒性试验了解长期反复接触低剂量化学物质可能引起的毒性效应。需进行蓄积试验和亚慢性、慢性毒性试验。一、蓄积试验及其方法：环境化学物的蓄积作用是慢性中毒的基础。（一）蓄积作用：某些物质以较小剂量反复作用于机体，可使机体对该物质的反应性增强，即一次染毒不引起明显中毒反应或死亡的剂量，经分次重复染毒后，可引起明显中毒或死亡，此种现象称为蓄积作用(accumulation)。可分两种：物质蓄积，即毒物在体内的排出量小于进入量，以致毒物在体内的贮留量增多为物质蓄积；功能蓄积：是毒物进入机体后，并末发现在体内明显贮留，但可引起机体功能改变的逐渐累积，导致对该毒物的反应性增强，此种现象称为功能蓄积。但两者的划分是相对的，既有差别，又互有联系。功能蓄积可能是由于贮存于体内的化合物或代谢产物的数量极微，目前分析方法尚不能检出的一种物质蓄积，或是由于每次机体接触化合物之后所引起的损害累积所致。耐受性(tolerance)是机体多次接触化学物质后．对该物质产生反应性减弱的现象，显示不易发生慢性中毒。（二）蓄积作用的测定方法有多种，常用蓄积系数法。蓄积系数是指多次染毒使半数动物出现某种效应的总剂量(ED50(n))与一次染毒引起同一效应的剂量，即半数效量(ED50(1))的比值。)1(50)(50EDEDKn若以死亡为毒效应指标，上式为)1(50)(50LDLDKn蓄积系数的测定：1．固定剂量法由Kagan和s帕nkevic(I954)提出，该法固定每天染毒剂量为1／20—1/5LD50，连续染毒，直至实验动物半数死亡。如果染毒剂量累计已达5个LD50动物死亡仍末达半数，实验均可告结束，计算蓄积系数，作出评价。2．递增剂量法由Lim等(1961)提出，先测定LD50（1），然后对另一组动物每天染毒，以4天为一期，开始给予0.1LD50。以后每期按1.5倍递增剂量，直至动物半数死亡，或实验已达24天，可结束实验，计算系数。3.二十天试验法本法是我国《食品安全性毒理学评价程序》(1984)针对上述两法的利弊而提出的。选用大鼠或小鼠每个剂量组雌雄各10只，以1／2、l／5、1／10、1／20LD50。分别对每组进行染毒，每日1次，共20天。如l／20LD50组动物有死亡，且有剂量—反应关系，则有较强蓄积作用；如1／20LD50组无死亡，则为弱蓄积。二、亚慢性毒性作用及其试验方法：1、目的：确定化学物亚慢性毒性的阈剂量和NOEL(最大无作用剂量或未观察到作用剂量)。2、试验期限：无完全统一认识，一般认为3-6月；现有学者主张喂饲：90天，因有报道认为3个月毒性效应与更长时间基本相同。呼吸道吸收：30或90天，每天6小时，每周5天。皮肤毒性：30天。3、试验动物的选择、饲养环境及染毒途径：选择：急性毒性实验证明对受试化学物敏感的物种或品系；环境：营养合理，饮水清洁、充足、温、光、湿适宜；染毒途径：尽量模拟人类在环境中接触受试化学物的途径，与急性毒性试验相似。4、剂量选择与分组剂量：1／20—I／5LD50，对于在体内不产生蓄积作用而排泄又快的物质可适当加大剂量，反之则可减少剂量。设3—4个实验组和1个对照组。实验组要求：要求在实验结束时，最低剂量组的动物不会产生可观察到的毒性反应，相当于亚慢性的最大无作用剂量；最高剂量组要求能引起动物明显的毒性反应，但又不引起动物死亡；中间剂量组应产生轻微的毒性反应，相当于亚慢性的阈剂量。另设一对照组。剂量选择可参照急性毒性和蓄积毒性的资料。如：以急性非致死性试验的阈剂量作为亚慢性试验的最高剂量。5、症状观察(1)一般性指标：如动物体重增长率、食物消耗率、活动能力等。为整体反应指标。体重明显下降常常是中毒或疾病的信号，也是一项比较敏感的指标。(2)化验指标：特异指标：用以测定化学物作用于机体后所引起的特异性反应。因此，它能更确切地阐明该物质对动物产生有害影响的闻剂量(浓度)及无作用剂量(浓度)。例如：有机磷农药：测定血中胆碱酯酶活性；芳香族硝基化学物：可测定高铁血红蛋白；无机F：可检查斑釉发生率及牙齿和骨氟含量。功能指标：血、肝、肾功能指标：一些酶的测定来实现的，目前常用的有谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(吻)、碱性磷酸酶(AKP)、乳酸脱氢酶(LDH)及其同功酶、r—谷氨酰转耽酶(r—GTP)等活性测定。有害物质在体内的分布、代谢及排泄指标：生物材料(血、尿、毛发等)中有害物质(汞、镉、铅、砷、氟等)含量测定。三、慢性毒性作用及其试验方法：慢性毒性试验是检测在较长时间内，以小剂量反复染毒后所引起损害作用的试验。1、目的：评价化学物在长期小剂量作用的条件下对机体产生的损害及其特点．确定其慢性毒作用阈剂量和最大无作用剂量。2、试验方法：（1）动