第十四节DNA的粗提取与鉴定

DNA的粗提取与鉴定主讲：黄冈中学优秀生物教师王小敏课题目标：1、通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理、化学性质；2、理解DNA粗提取与鉴定的原理。课题重难点：DNA的粗提取和鉴定方法。一、基础知识（一）提取DNA的方法1、提取生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2、提取DNA的基本思路利用DNA与RNA．蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。3、DNA粗提取的原理（1）DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同。DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最小；在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最大。（2）DNA不溶于酒精DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。（3）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性①蛋白酶——水解蛋白质，对DNA没有影响。②高温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃，而DNA在80℃以上才会变性。③洗涤剂——溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质，但对DNA没有影响。（二）DNA的鉴定沸水浴条件下，DNA遇二苯胺被染成蓝色。原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA。二、实验设计（一）实验材料的选取1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2～3种实验材料）2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、动物细胞——容易破碎10mL鸡血＋20mL蒸馏水→同方向搅拌→3层尼龙布过滤→滤液讨论1：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。2、植物细胞①植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜。②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。讨论2：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。（三）去除滤液中的杂质最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。阅读教材提供的三种方法，分析其中的原理。方案一：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。具体做法是：在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤去除溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。原理：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同。思考：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10～15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。方案三：将滤液放在60～75℃的恒温水浴箱中保温10～15min，注意严格控制温度范围。讨论3：方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。（四）DNA的析出与鉴定1、DNA的析出用冷却的酒精析出DNADNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95%），静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水。2、DNA的鉴定具体做法：试管2支，编号甲、乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色丝状物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均匀→沸水浴5min→观察颜色变化。三、实验操作四、操作提示在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。为了提高DNA纯度，在科学实验中通常使用的洗涤剂有十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）。课堂小结：-返回-同步测试一、选择题1、在研究DNA的基因样本前，采集来的血样需要蛋白水解酶处理，然后用有机溶剂除去蛋白质。用蛋白水解酶处理血样的目的是（）A．除去血浆中的蛋白质B．除去染色体上的蛋白质C．除去血细胞表面的蛋白质D．除去血细胞中的所有的蛋白质，使DNA释放，便于进一步提纯2、与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是（）A．操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度B．在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整C．加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出D．当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCl的浓度相当于0.14mol/L3、洗涤剂能够瓦解（），但对DNA没有影响。A．细胞壁B．细胞膜C．细胞核D．细胞质4、在沸水浴的条件下，DNA遇（）会被染成蓝色。A．斐林试剂B．苏丹Ⅲ染液C．双缩脲试剂D．二苯胺5、在DNA提取过程中，最好使用塑料试管和烧杯，目的是（）A．不易破碎B．减少提取过程中DNA的损失C．增加DNA的含量D．容易洗刷6、下列操作中，对DNA的提取量影响最小的是（）A．使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出DNA等核物质B．搅拌时，要使用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌C．在“析出DNA粘稠物”时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增加D．在用酒精沉淀DNA时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却E．在DNA的溶解和再溶解时，要充分搅拌7、DNA的粗提取中，将与滤液体积相等的、冷却的（），静置2-3min，溶液中会出现白色丝状物。A．0.9%的NaClB．0.14mol/L的NaCl溶液C．质量分数15%的HClD．体积分数为95%的酒精溶液8、以血液为实验材料时，需要向血液中加入（），防止血液凝固。A．醋酸钠B．龙胆紫C．柠檬酸钠D．醋酸洋红9、在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（）A．加快溶解DNA的速度B．加快溶解杂质的速度C．减少DNA的溶解度，加快DNA析出D．减小杂质的溶解度，加快杂质的析出10、去除滤液中的杂质时，直接在滤液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（）分解蛋白质。A．胃蛋白酶B．胰蛋白酶C．木瓜蛋白酶D．肠肽酶DCBDBBDCCC二、非选择题11、提取鸡血中DNA时，要除去血液中的上清液，这是因为什么？显示答案11、因为上清液是血浆，不含有血细胞，DNA存在于沉郁试管底部的鸡血细胞的细胞核中，所以提取鸡血中的DNA时，要除去血液中的上清液。12、填写本实验完成下列实验操作时所用试剂。（1）提取鸡血细胞中核物质____________________。（2）溶解核内DNA：____________________。（3）析出2mol/LNaCl溶液中的DNA____________________。（4）DNA粘稠物的再溶解____________________。（5）提取杂质较少的DNA白色乳状丝状物____________________。（6）DNA的鉴定____________________。显示答案12、（1）蒸馏水（2）2mol/LNaCl溶液（3）蒸馏水（4）2mol/LNaCl溶液（5）冷却的95%的酒精（6）二苯胺13、关于DNA粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料的原因是什么？请回答下列问题：（1）鸡血细胞中红细胞__________，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中__________细胞树木较多，可以提供丰富的__________。（2）实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料，而不用鸡全血，主要原因是____________________。（3）生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验要求完成实验步骤后，结果是__________，这是因为这些动物和人一样，成熟的红细胞中__________，但若改用动物肝脏做实验材料，实验能顺利进行。这是因为____________________。（4）若选用动物肝脏做实验材料，在提取之前，最好增加__________程序，使组织细胞更易分离。显示答案13、（1）含细胞核；红；DNA（2）鸡血细胞液中DNA相对含量（3）很难提取到DNA；无细胞核；肝细胞有细胞核（4）研磨-END-课外拓展以菜花为实验材料进行DNA的粗提取课前准备将新鲜菜花和体积分数为95%的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24h。提取DNA的具体步骤1、取材称取30g菜花，去梗取花，切碎。2、研磨将碎菜花放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min。研磨液的配制方法如下。将10.1gTris加入到50mL蒸馏水中，使其溶解，然后，用2mol/L的HCl溶液调节pH至8.0，再加入8.76gNaCl、37.2gEDTA、20gSDS。待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至1000mL。教材中建议采用洗发香波、洗涤剂等一些去污剂，使植物细胞膜破碎，释放DNA。学生可以设置对照实验，比较哪一种方法可以提取到纯度更高的DNA。一般实验室提取高纯度的DNA都采用一种阳离子去污剂——十六烷三甲基溴化铵分离缓冲液，使细胞膜破碎，同时将DNA与植物中多糖等杂质分开，再用氯仿—异丙醇混合液（体积比为24∶1）抽提去除杂质蛋白，得到高纯度的DNA。3、过滤在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中（有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000r/min的转速，离心2～5min，取上清液放入烧杯中）。在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。4、沉淀将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液（玻璃棒不要直插到烧杯底部）。沉淀3～5min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上。-END-高考解析例1、有人将猪血取出后，经过滤获得猪血细胞液，经过一系列实验步骤后，发现实验效果与下列哪类动物相同（）A．两栖类B．鱼类C．爬行类D．鸟类E．没有相同的答案：E解析：猪红细胞无细胞核，上述四类动物的红细胞中均有细胞核。例2、在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是（）A．稀释血液、冲洗样品B．使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出C．使血细胞破裂、增大DNA溶解量D．使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA答案：B解析：第一次加入蒸馏水的作用是使血细胞过度吸水而破裂，以便核内物质释放。第二次加入适量蒸馏水，是为了降低NaCl浓度，使DNA因溶解度达到最小而析出。例3、检测DNA物质的试剂是（）A．斐林试剂B．95%的酒精C．甲基绿溶液D．二苯胺试剂答案：C、D解析：甲基绿溶液和二苯胺试剂均可鉴定DNA。DNA遇甲基绿溶液呈绿色，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色。例4、下列操作中，对DNA的提取量影响较小的是（）A．使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出DNA等核物质B．搅拌时，要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动C．在析出DNA黏稠物时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中黏稠物不再增多D．在用酒精沉淀DNA时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却E．在DNA的溶解和再溶解时，要充分搅拌答案：B解析：在B所述的操作中，可以保证DNA分子的完整性，但不影响提取量。除了A、C、D、E影响DNA的提取量外，使用塑料器皿也可以减少DNA在操作