病毒RNA提取方法

病毒RNA提取方法关键词：病毒RNA提取2008-06-1100:00来源：互联网点击次数：4393一、异硫氰酸胍提取法（这是提禽流感病毒的详细步骤，供参考）1、取200ul样品数+阴性对照+阳性对照加入1.5ml灭菌eppendorf管；2、加600ul异硫氰酸胍，然后加入对照和样品，再加200ul氯仿，颠倒混匀；3、13000rpm离心15min；4、在第3步离心快结束时，另取同样多eppendorf管，加入400ul于-20℃预冷的异丙醇；5、取第3步离心的上清（一定不要吸取到中间白色层，第3步离心结束往外拿的时候，管子尽量不要倾斜）转移到第4步准备的管中，颠倒混匀；6、13000rpm离心15min，轻轻倒去上清，在吸水纸上尽量沾干液体；7、加600ul75％乙醇，颠倒数次以洗涤残存异丙醇；8、13000rpm离心15min，轻轻倒去上清，在吸水纸上尽量沾干液体；9、4000rpm离心10sec，将管壁残存液体甩到底部，用微量枪头吸干，室温干燥2－3min（不可过分干燥，防止下一步RNA不溶解）；10、加入20ulDEPE水(加入depc的纯水高压后的水即为DEPE水)，轻轻混匀溶解RNA。2000rpm离心5sec，冰上保存备用（最好2小时内使用，以免RNA降解）。二、TRIzolLS提取法所提取物为血清、血液、细胞培养液、鸡胚尿囊液等液体中的病毒。提取时尽量在人少时进行，防止空气中RNA酶的污染。所用一切物品也应是无RNA酶。1、在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzolLS500ul，充分混匀，室温放置10min；2、加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），室温放置10min（由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心）；3、4℃，13000r/min离心15min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）；4、加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min；5、4℃，13000r/min离心15min，（这时乍一看会发现管子里好像没有东西，再仔细看看，会发现靠近管底的壁上有一星点的白色沉淀物，就是它了）用枪小心吸去所有上清；6、1ml75%乙醇洗一遍，4℃，8000r/min离心10min，（这时又会发现管子没东西了，不要担心，有的，但是因为量太少看不见罢了）用枪小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min；7、加入适量DEPC处理水。（如果材料来源丰富的话，加入的水量为下一步RT的total减去其他试剂的量；若要省着点用，则自己看着办了，尽量不要加太多的水）；8、建议立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇后冻存于－70℃，可保存一年；若加入DEPC水后则只能在－20℃保存1个月左右。三、Trizol法提取法（这是提禽流感病毒的步骤，供参考）Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。1、取鸡胚尿囊液，加入5-10倍体积Trizol液，混匀；2、室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟；4、弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混匀，4℃下7500g离心5分钟；5、重复第4步；6、小心弃去上清液，然后室温干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；7、然后将RNA溶于水中，放置10分钟。[注意]1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作；2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。