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第七章：病毒基因工程第一节病毒载体第二节病毒基因工程应用举例本章重点1.几种重要的基因工程载体2.噬菌体展示的原理人们研究病毒，一方面是为了控制病毒性疾病，另一方面也是为了利用病毒服务人类。1953年Watson和Crick发现了DNA双螺旋结构，开创了分子生物学的新时代。1970年H.M.Temin和D.Baltimore对RNA肿瘤病毒反转录酶的发现，不仅使DNA复制的中心法则得以完善和发展，同时使RNA反转录为cDNA成为实验室常规手段，也使基因工程这门学科得到了飞速的发展。病毒基因工程就是利用重组DNA技术，以病毒为载体，高效表达病毒基因及其它外源基因或者对病毒基因组进行改造，用于制备防治病毒性疾病的疫苗、杀虫剂、进行基因治疗及开展有关蛋白功能研究。第一节病毒载体一、噬菌体载体1、λ噬菌体线状dsDNA，总长度为48502bp，在DNA分子的两端各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5’单链突出序列，即黏性末端。λ噬菌体DNA进入寄主细胞后，通过两个末端互补结合形成黏性末端位点，使DNA环化，开始复制。λ噬菌体整个基因组可分为三个部分①左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的结构蛋白质。②中段：长约20kb，位于基因J和N之间，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列。③右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。λ噬菌体的改造2、λ噬菌体的缺陷与改造λ噬菌体的缺陷：⑴基因组太大（49kb）；⑵酶切点太多，它有5个BamH1位点（G↓GATCC），6个BgⅠ位点（A↓GATCT），5个EcoRⅠ位点（G↓AATTC）。⑶野生型只能接纳一定长度的DNA。接纳49kb×5%=2.45kb的DNA。λ噬菌体的改造⑴切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；⑵去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；⑶增加标记基因（remarkergene）。（1）插入型载体：λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建，一般容许插入5-7kb外来DNA。•cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。•LacZ基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。cIEcoRILA32.7RA10.6λgt10lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16A是重组子筛选的一种方法：是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。（2）替换型载体：只有DNA的长度大于野生型的75%而不超过105%，才能包装成噬菌体。插入外源基因20kb。没有外源基因插入的噬菌体不能包装。（3）cos质粒：如果将左右臂和中段都去除，仅留下λDNA两端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载体。粘粒可插入45kb长的外源DNA，然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库的构建。2、丝状噬菌体大肠杆菌的M13噬菌体为单链环状DNAM13噬菌体的生物学特性：M13噬菌体的外型呈丝状，由外壳包装蛋白和正链DNA组成。DNA全长6407个核苷酸，基因组90%以上的序列可编码蛋白质，DNA上有11个基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。成熟的噬菌体只感染雄性大肠杆菌，M13噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长。2700个外壳蛋白分子M13噬菌体基因组可编码3类蛋白质:复制蛋白(基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ)形态发生蛋白(基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ)结构蛋白(基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ)。基因组DNA为正链，按基因Ⅱ至基因Ⅳ方向合成，与噬菌体的mRNA序列同义。大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13DNA载体的构建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列载体lacZpolylinker大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13噬菌体的生物学特性：感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA+DNAIIVθ复制滚环复制+DNAθ复制在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体DNA（正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链DNA，用于DNA的复制，因此这种双链DNA称为复制型DNA（replicativeformDNA），即RFDNA。通过θ复制方式，RFDNA进行扩增，基因的转录也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。当基因Ⅱ蛋白在亲代RFDNA的正链特定位点上产生一个切口时，便启动噬菌体基因组进行滚环复制。此时，在大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅰ的作用下，以负链为模板在切口的3'末端加入核苷酸，并持续DNA的合成，用新合成的DNA替换原有的正链。当复制叉环绕模板整整一周时，被取代的正链由基因Ⅱ产物切去，经环化后形成单位长度的噬菌体基因组DNA。在感染开始的15～20分钟内，这些子代正链在宿主细胞酶的作用下，又转变成RFDNA，然后以之为模板继续转录并继续合成子代正链DNA。当感染细胞内累计有100-200个RFDNA时，细胞内也产生了足够的单链DNA结合蛋白，即基因Ⅴ蛋白。该蛋白可以抑制翻译活性，特别是抑制基因ⅡmRNA的翻译，并且强烈地结合在新合成的正链DNA上，阻止其转化成RFDNA。此时，DNA的合成几乎只产生子代正链DNA。另外，基因Ⅹ蛋白和基因Ⅴ蛋白也是噬菌体特异DNA合成的强力抑制子，从而限制感染细胞内RFDNA的数量。结果，感染细胞内RFDNA的数目和子代正链DNA的产生速率都能保持适度。•单链DNA的酶切和连接是比较困难的，因此M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RFDNA。RFDNA很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。•成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RFDNA或ssDNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。M13噬菌体载体6.4kb单链环状正链DNA基因组。作载体的优点：(1)RFDNA和SSDNA都可转染E.coli，产生噬菌斑；(2)无包装限制问题（可6倍于M13基因组）；(3)复制以双链环形DNA为中间媒介；(4）易测出外源DNA的插入方向；(5）可产生能直接测序的单链DNA分子。二、典型的杆状病毒表达系统昆虫杆状病毒表达载体系统（bculovrirusexpressionvectorsystem，BEVS）于20世纪80年代初期问世，已被公认为当今基因工程四大表达系统（即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一，应用最广的是苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)与S9细胞系。AcMNPV是有囊膜的闭合环状dsDNA病毒，的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白。多角体蛋白是形成包涵体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％～50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力。另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆，这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。AcNPV病毒用作外源基因的表达载体，通常是通过体内同源重组的方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒。BEVS通常由转移载体、亲本病毒和重组介质三部分组成，其技术路线分以下几步：①先将外源片段克隆到转移载体质粒中，置于杆状病毒启动子控制之下，上下游各有一段与亲本病毒DNA相匹配的侧翼序列，构建成转移载体；②然后把转移载体和野生型病毒共转染昆虫细胞，通过同源重组将外源片段插入到病毒基因组；③再以特定的筛选标记和方法获得重组病毒。同源重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。杆状病毒表达体系的优点：•杆状病毒表达体系具有与高等真核细胞类似的蛋白修饰，加工和转运体系，其表达的外源基因产物在抗原性、免疫原性和功能上均与天然蛋白相似。•构建杆状病毒载体的主要基因为多角体基因ph和p10，为病毒复制非必须基因。•多角体基因ph和p10有非常强大的启动子，可使目的基因大量表达，可达细胞总蛋白量的25%。•杆状病毒基因组较大（130Kb），适合克隆大片段外原基因，还可以同时表达几个基因。•杆状病毒不感染脊椎动物，比较安全。三、动物病毒载体1、SV40（猴病毒40）病毒作为载体（1）SV40基因组（多瘤病毒科）其基因组为共价闭合环状双链DNA，只有5243个碱基对。是第一个完成基因组DNA全序列分析的动物病毒。（2）SV40的复制和增殖•SV40感染敏感的猿猴细胞后，经过8-12小时的潜伏期，脱去外壳，DNA进入细胞核。•首先启动早期转录，在细胞质中翻译产生T和t抗原。•当两种抗原积累到足够量时，DNA开始复制，同时启动晚期转录，翻译产生壳蛋白VP1、VP2、VP3，将DNA包装成病毒颗粒。•当细胞内病毒颗粒多达105时，细胞破裂，释放出大量病毒颗粒。SV40病毒基因组早期基因编码两种肿瘤抗原(tumorantigen，T抗原)，其分子量分别为94000(大T抗原)和17000(小T抗原)。T抗原有以下的作用:①通过抑制宿主细胞Rb和p53基因，促使细胞分裂；②阻止细胞凋亡；③结合在SV40的复制起点，起始病毒复制；④关闭病毒早期转录；⑤启动病毒晚期转录；⑥在病毒组装中起作用；⑦小T抗原对于细胞的转化不是必需的，但可起加强作用。SV40DNA中的非必须区很小，故在向SV40插入外源基因时，须除去某些区段，同时采取相应补救措施。早期基因被置换时，不能合成T抗原，一般采用cos细胞来解决。Cos细胞是已经被SV40DNA转化了的猴传代细胞，其染色体内的SV40DNA可编码T抗原，但没有复制起点，病毒不能复制。将重组DNA导入cos细胞，可形成含有重组DNA的病毒颗粒。（3）