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第五章病毒检验基本技术一、标本的采集、处理与运送一、标本采集：采集时间为病程初期或急性期；二、标本的处理：应进行预处理三、标本的运送：1、病毒抵抗力弱，室温会很快灭活，应立即送实验室2、不能立即检测，放入冻存液并加甘油或二甲亚砜（DMSO），并防止反复冻融二、病毒的培养条件培养工具：实验动物、鸡胚、体外培养的器官和细胞一、组织培养病毒在细胞内的增殖及对细胞的作用，可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象及对细胞的作用及通过对“指示病毒”的感染等法加以判断。1、培养的玻璃器皿的要求：用硫酸和重铬酸钾溶液浸泡清洗后使用2、组织培养的营养液：成分：氨基酸、糖类、无机盐、维生素、辅助因子等常用的人工综合营养液：MEM、RPMI1640。如用人工综合营养液配制细胞生长液要加如下物质：①、血清（适量）、谷氨酰胺溶液：动物血清含有细胞生长的各种营养因子，促进细胞贴壁和生长，具有很强的酸碱缓冲能力②、规定量的抗生素：防止细菌污染③、NaHCO3修正PH④、HEPES溶液（根据情况加入）:可使生长液具有较强的PH缓冲能力⑤、胰蛋白酶和EDTA溶液：使组织和成片细胞分散成单个细胞。EDTA溶液又称为Versen溶液3、细胞培养液可分为细胞生长液（发育生长，营养丰厚）和细胞维持液（延缓代谢）生长液和维持液的区别：血清含量不同4、PH：7.2-7.65、全过程的技术关键：防止污染二、细胞株的保存含10%二甲亚砜的血清可作为悬浮细胞的液体在液氮中保存细胞三、使用的细胞类型：原代细胞、二倍体细胞、传代细胞注：原代细胞核传代细胞的区别是是否能在体外无限传代四、细胞的纯化：细胞克隆技术三、病毒的常规实验室诊断一、病毒的分离与鉴定1、病毒增殖的判定2、细胞病变（CPE）:CPE的表现为细胞破坏、肿大、融合成合胞体、无明显变化等。CPE常具有病毒种的特性，因此常作为病毒鉴定标准之一。3、病毒蚀斑技术（空斑）：病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。主要用于病毒的纯化或病毒悬液中病毒含量的测定。4、病毒感染力的滴定：试验动物测定LD50（半数致死量）组织细胞上测定TCID50（半数细胞培养物感染量）5、病毒的保存：冷冻干燥保存二、病毒的形态学检查1、光学显微镜仅限于大病毒颗粒（痘类病毒）和病毒包涵体的检查2、电子显微镜检查法①、电镜直接检查法适宜病毒感染早期，标本中出现病毒颗粒。标本粗提浓缩后用磷钨酸负染后电镜直接观察，做出诊断②、免疫电镜检查法更特异、更敏感病毒制成悬液加入特异性抗体，使病毒颗粒凝结成团，提高检出率。3、超过滤法用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液，将滤液接种动物或鸡胚，或血凝素测定病毒是否通过滤膜，判断病毒大小4、超速离心法测沉降系数（S），计算病毒大小5、X线晶体衍射法看图谱。标本必须为晶体，可用于无包膜病毒研究三、免疫学鉴定鉴定病毒的种类乃至型别四、病毒的分子生物学鉴定测定核酸和蛋白质核酸测定：聚合酶联反应技术、探针技术、核酸序列测定蛋白测定：免疫测定技术、电泳技术、质谱技术。