病毒血症期病人血清登革病毒I-IV型特异性核酸检测

检测步骤：1.取病人血清140µl，加入560µl缓冲液（AVL），在漩涡混合器上振荡混匀，室温静置10min。2.加入560µl无水乙醇终止反应。3.裂解后的液体分两次移入管柱，每次13000r/min离心13000min，此时病毒RNA会吸附在管柱底部的膜上。4.加500µl洗液（AW1）至管柱上，离心机13000r/min离心2min，弃去AW1。5.加500µl洗液（AW2）至管柱上，离心机13000r/min离心2min，弃去AW2。6.进一步离心13000r/min3min以彻底去除残留在膜上乙醇。7.加入60µl洗脱液（AVE），室温静置3-5min。8.将管柱置于1.5mL离心管上，4℃离心14000r/min2min，得到的RNA即可进行RT-PCR检测。9.PCR的扩增在0.2mLPCR反应管中加入下列成分后，加入10µl上述提取的病毒RNA，混匀后稍稍离心，直接置基因扩增仪进行扩增。10×OneStepRNAPCRBuffer5µl25mmol/L氯化镁10µl10mmol/LdNTP5µlRnaseInhibitor(40U/µl)1µlAMV-OprimizedTaq1µlAMVRTaseXL(5U/µl)1µlD1(10μmol/L)2.5µlD2(10μmol/L)2.5µlRnaseFreedH2O12µl反应条件：逆转录50℃45min，PCR反应94℃4min，55℃60s，72℃60s一次，再进行35次循环的94℃35s，55℃35s，72℃35s，最后再以72℃10min结束。结果判定：取2-10µl扩增产物与1-2µl含溴酚蓝的样品缓冲液混合，加到1-2％孔中，用1×TBE作电泳缓冲液进行电泳，电泳完毕后置紫外灯下观察扩增产物