病毒转基因技术原理腺相关病毒

主要内容腺相关病毒简介腺相关病毒载体转基因技术原理腺相关病毒载体的医学应用优缺点总结和复习思考题第一节腺相关病毒简介生物学特性致病性与免疫性第一部分生物学特性血清型病毒结构病毒复制对理化因素的抵抗力血清型AAV是从腺病毒的污染物（1965年）、人群或非人灵长类动物等的组织中分离鉴定到的。共鉴定了11个AAV血清型以及108个AAV变株（variants）。通过签名PCR（signaturePCR）技术，利用高度保守序列扩增Cap基因的一小段可变区的DNA序列，以筛检是否是新的AAV分离株，然后利用PCR技术获得新的AAV分离株的Cap或（和）Rep基因的全长序列。在人类、非人灵长类动物、马、猪、牛、绵羊、山羊和蛇等的不同组织器官，发现了大量的具有多样性的AAV的基因组。但新分离的病毒株，尚未进行血清学分型，通称为变株。AAV不同血清型和变株的基因组结构相对较为保守，与AAV-2型较为类似，不同血清型的衣壳蛋白结构中表位的差异。50~80%AAV-2抗体在人群中检测出。转导不同组织器官的AAV最优血清型组织最优血清型肝脏AAV-8,AAV-9骨骼肌AAV-1,AAV-7,AAV-6,AAV-8,AAV-9中枢神经系统AAV-5,AAV-1,AAV-4肺脏AAV-9心脏AAV-8肾脏AAV-2胰腺AAV-8眼睛（光受体细胞）AAV-5,AAV-4不同血清型在吸附细胞表面能力、病毒受体、胞内交通和抗原性等方面具有明显的区别，以及针对不同组织和细胞的转导效率不一致，体现出不同的组织极性（tissuetropisms）病毒结构AAV-220–30nm，基因组为线性、单链的DNA分子。正链和负链的单链DNA分子，以同等效率包装在病毒体衣壳中。基因组全长4679个核苷酸。基因组包括两个ORF，三个启动子（启动子以在基因组中处的作图位置标示，分别为p5、p19和p40启动子），以及两末端为145个核苷酸的反向末端重复序列（invertedterminalrepeat，ITR）ITRITR中的前125个核苷酸具有回文结构，其中还存在两个小的内部回文结构，可自身折叠后经碱基配对、形成T字形的发夹结构；剩余的20个核苷酸，保持非配对状态，称为D序列（Dsequence）。ITR中还具有Rep结合元件（Repbindingelements，RBEs)RBE和RBEˊ，以及一个末端解离位点TRS（terminalresolutionsite）等重要序列。ITR是在AAV生物学中重要的顺式（cis）作用活性元件，在病毒复制中具有重要作用：在非容许条件下，ITR在病毒复制的负调控中起关键作用；在容许条件下，作为病毒基因组复制的起点和引物。ITR对病毒基因组的包装、转录、以及位点特异性的整合，均是必需的。左端的ORF（Rep基因）可编码四个Rep蛋白，即Rep78，Rep68，Rep52和Rep40，均具有螺旋酶和ATP酶活性。较大的Rep蛋白如Rep78和Rep68，由P5启动子指导转录，分别由未剪辑和剪辑的转录物产生，具有链和位点特异的核酸内切酶活性（切割点在TRS附近）以及位点特异的DNA结合活性（结合于RBE）。因此它们是重要的调节蛋白，以反式（trans）方式参与调节AAV复制周期的所有阶段，如DNA复制、位点特异性整合、整合病毒基因组的拯救，调节病毒和细胞内基因表达的启动子等。较小的Rep蛋白如Rep52和Rep40，由P19启动子指导转录，分别由未剪辑和剪辑的转录物产生，参与单链DNA的聚集并包装入病毒体的衣壳。右端的ORF（Cap基因）由P40启动子指导转录，产生两个转录物，可编码三个病毒衣壳蛋白，即VP1，VP2和VP3。这些衣壳蛋白利用共同的ORF，但转录起始位置不一致。一般而言，VP1、VP2和VP3的分子比是1：1：8/10。构成这些病毒体的衣壳蛋白的比例的差异，最有可能会影响病毒的感染性，尤其是VP1含量低的情况下。缺乏VP1的病毒体没有感染性。病毒复制八个主要步骤：•与细胞表面受体黏附或结合•内吞（endocytosis）•在细胞内经内吞体运输•释放出内吞体•进入胞核•脱壳并释放病毒基因组•启动双链DNA的合成•整合到细胞染色体或以附加子形式持久表达病毒基因•不同血清型的AAV感染的细胞类型不同，这取决于不同血清型的AAV靶向细胞表面的受体的差异。而且这也决定了不同血清型的病毒在细胞内的不同的运输途径AAV病毒的糖苷受体和辅助受体AAV血清型受体和辅助受体AAV-1α2–3/α2–6NlinkedSAAAV-2HSPG,FGFR1,HGFR,integrins,37/67kDaLamRAAV-3HSPG,37/67kDaLamRAAV-4α2–3OlinkedSAAAV-5α2–3NlinkedSA,PDGFRAAV-6HSPG,α2–3/α2–6NlinkedSAAAV-7AAV-837/67kDaLamRAAV-9Galactose,37/67kDaLamRAAV病毒基因组的复制模型左为RFm，右为RFd）Rep蛋白AAV成功感染细胞后，依据是否有辅助病毒存在的情况下：裂解阶段（lyticstage）和溶原性阶段（lysogenicstage）AAV的复制周期可以分为两个阶段溶原性阶段（lysogenicstage）:在缺乏辅助病毒如AdV、HSV等感染的情况下，AAV几乎不能复制，基因表达受到抑制，AAV基因组会整合到染色体q13.4的一个4kb大小的区域（命名为AAVS1），建立潜伏感染裂解阶段（lyticstage）:在辅助病毒如AdV、HSV-1等共同感染的情况下，AAV可以经历核酸复制、病毒基因表达和病毒体产生等过程，最终形成产毒性感染受到羟基脲、拓扑异构酶抑制剂或紫外线照射等处理，在缺乏辅助病毒的情况下，也可以刺激AAV的复制。AAV的复制在某些细胞也可以自发发生。染色体q13.4的AAVS1位点中最少33bp的序列，包含由8个核苷酸分开的RBE样和TRS样序列，对AAV的靶向整合是必须而且充分的条件。位点特异性的整合过程即使是在Rep78和Rep68蛋白理想表达的条件下，未必是完全是位点特异的，大约40-70%的整合发生在AAVS1位点溶原性阶段（lysogenicstage）AdV能提供辅助功能的基因有E1a，E1b55K，E2a，E4orf6和VARNA（viralassociatedRNA）。HSV-1能提供辅助AAV复制功能，至少涉及HSV-1的复制蛋白，包括helicase/primasecomplex(UL5,UL8,和UL52)和DNA结合蛋白ICP8（UL29）。裂解阶段（lyticstage）对环境理化因素的抵抗力AAV对理化因素如温度和pH的抵抗力强。对化学消毒剂如1％的次氯酸钠、2％戊二醛、0.25％十二烷基硫酸钠等敏感。第二部分致病性与免疫性约80%的人群的血清抗AAV抗体阳性，这些抗体针对的血清型是AAV-1，2，3和AAV-5型。但针对AAV在人群自然感染史的认识非常少，且未发现这些感染导致临床典型的病理改变或疾病。蛋白表达型腺相关病毒载体基因打靶型腺相关病毒载体rAAV的纯化和定量―三成分包装系统―自我互补型AAV载体（self-complementaryAAVvector，scAAV）―反式剪接型AAV载体（trans-splicingAAVvector,tsAAV）―衣壳蛋白修饰型AAV载体第二节腺相关病毒载体转基因技术原理第一部分蛋白表达型腺相关病毒载体三成分包装系统:―重组AAV病毒体（rAAV，ssAAV,Sigle-strandedAAV）的组装，必须依赖于三种成分，即：转移载体，由转基因表达读框以及两侧的野生型AAV的ITR区组成；AAV的cap和rep编码序列；辅助病毒功能―建立了各种各样的方法和细胞培养系统以制备rAAV，并且这些方法和培养系统还在不断完善之中―目前最常使用的rAAV载体系统是二(或三)质粒转染HEK293法(two/threeplasmidtransfectionofadherentHEK293cells)，包括rAAV转移载体，rAAV辅助质粒和(或)辅助病毒质粒三部分三成分包装系统:•rAAV转移载体仅保留野生型AAV基因组中决定其复制、包装和整合必须的顺式作用元件——基因组两端的ITR序列；全部去掉rep和cap基因及其控制序列，用外源基因及其控制序列代替。实际包装外源基因的上限仅为4.4kb。•rAAV辅助质粒是克隆的ITR缺失的野生型AAV的基因组，以反式方式提供rep和cap基因编码蛋白的功能。目的在于病毒包装过程中，避免野生型AAV病毒的形成。•AdV辅助病毒质粒，包括其起辅助功能的基因E2a，E4orf6和VARNA。•E1a和E1b55K可由HEK293细胞提供。第一部分蛋白表达型腺相关病毒载体三成分包装系统优点:三成分包装系统不足:―快速、有效，―避免了辅助病毒的使用―当rAAV用于心脏、肝脏和骨骼肌等器官时，制备大量的rAAV耗时、耗力―采用大规模悬浮细胞培养技术可克服这一障碍，并研制了三种替代的方法第一部分蛋白表达型腺相关病毒载体三成分包装系统的大规模悬浮细胞培养技术:细胞类型细胞系AAV功能辅助病毒功能rAAV载体哺乳动物细胞HEK293pRepCappAdpAAVHEK293pRepCap/AdpAAVHeLa/RepCap细胞提供Ad5Ad/rAAVHeLa/RepCap/rAAV细胞提供Ad5细胞提供A549/RepCap细胞提供Ad5Ad/rAAVA549/RepCap/rAAV细胞提供Ad5细胞提供HeLa/RepCap/rAAV细胞提供HSV-1细胞提供293/rAAVHSV-RepCapHSV载体提供细胞提供HEK293HSV-RepCapHSV载体提供HSV-rAAVBHK21HSV-RepCapHSV载体提供HSV-rAAV昆虫细胞Sf9Bac-Rep+Bac-VPBac载体提供Bac-rAAVSf9Bac-RepCapBac载体提供Bac-rAAVSf9/RepCap细胞提供Bac载体提供Bac-rAAV―采用重组杆状病毒表达系统BEVS（baculovirusexpressionvectorsystem），提供三种成分并感染昆虫细胞或利用包含cap和rep的稳定包装昆虫细胞系；―包含cap和rep的稳定包装哺乳动物细胞系，并通过感染AdV提供辅助功能；―利用哺乳动物细胞系和重组HSV-1提供cap和rep，rAAV和辅助功能。第一部分蛋白表达型腺相关病毒载体策略2constructedAdhelperplasmidsthatarecotransfectedontoE1a/E1b-expressing293cellsalongwithaplasmidthatexpressestherepandcapgenesandavectorplasmid60°C,30minForty-eighttoseventy-twohoursaftertransfectionAdisinactivatedbyheattreatment自我互补型AAV载体（self-complementaryAAVvector，scAAV）―重组AAV（ssAAV）进入细胞后，在启动蛋白表达之前，重要的限速步骤是单链基因组需要转换成为双链基因组。―McCarty等缺失了rAAV的一个ITR区的TRS（△trs），阻止其突变末端参与复制的启动，最终形成一个呈现串联的、单链的反向重复的基因组，其两端是野生型的ITR，但中间一个是突变型的ITR。―脱出衣壳后，将以中间突变的ITR为基础折叠形成发夹结构，形成自我互补的双链，因此，在组织或体外实验中可以快速和高效表达。―这种类型的scAAV的包装能力仅为ssAAV的一半，大约2.3kb。―最近的进展是利用scAAV表达小干扰RNA(siRNA，small-interferenceRNA)。第一部分蛋白