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1第四章染色与染色剂未加染色的切片在显微镜下除了能够辨认细胞和包核的轮廓以外，看不清楚其他任何结构。即使由于组织内部各种物质的折射指数不同，从光线的明暗上能使我们看到一些组织结构，但也是极其简单而有限的。远远不能满足观察和诊断的要求。我们不仅要通过显微镜视野来看到组织和细胞的形态结构，而且还要通过组织和细胞的形态变化来研究它的发生和发展。因此染色的技术才逐渐发展成为制片过程中的一个重要环节。它较固定、脱水、包埋、切片等步骤远为复杂，理论性强，技术要求严格，已经成为一门独立的科学，它在组织学，病理学等学科中已占有相当的地位。第一节染色的基本原理染色就是利用染料在组织切片上给与颜色，使其与组织或细胞内的某种成分发生作用，经过透明后通过光谱吸收和折射，使其各种微细结构能显现不同颜色，这样在显微镜下就可显示出组织细胞的各种成分。染色剂与组织细胞相结合而使组织细胞着色的过程与物理和化学作用两者都有关系。一.染色的物理现象1.溶解性：这种染色最典型的例子就是脂肪染色，苏丹类染色剂为脂溶性染料，它可以被脂质溶解，使脂质着色，就是利用染色剂在脂质中的溶解度大于在酒精等溶剂中的溶解度这一特性。因此，当苏丹类的酒精溶液与组织细胞中的脂质接触时，染色剂就从溶液中“转移”到脂质中去，而使脂质着色。2.吸附作用：较大物体有从周围介质吸附小颗粒到自身的特性。有些染色则是染色剂分子通过渗透和毛细管作用而被吸收或沉淀到组织，细胞的小孔中去而着色的。例如活性炭吸附各种分子，甚至胶质和微生物等较大的颗粒一样。二.染色的化学反应酸性染料和碱性染料的染色作用常是对立的，而不是一致的。任何染料均可电离，离解出阳离子或阴离子。酸性染料中的酸性部分有染色作用的是阴离子；碱性染料中的碱性部分有染色作用的是阳离子，细胞内同时含有酸性和碱性物质，酸性物质与碱性染料中的阳离子相结合，如细胞核（含有核酸）黏液和软骨基质呈酸性部分被盐基性染料苏木素所染、反之碱性物质与酸性染料的阴离子相结合，如细胞浆及其内部的某些颗粒物质被酸性染料伊红所染。染料的颜色基不是在阳离子，就是在阴离子上，这些离子将因组织反应不同而发生化学结合，如显示含铁血黄素的普鲁士兰反应是最典型的例子。但是，大量染色的化学反应并不象铁反应那样明确，实际情况远为复杂。这是因为蛋白质分子是个分子量自几万至几百万的大分子，每个分子中含有很多阳离子和阴离子基因，在等电点时能形成游离的两性离子，如：COOHCOO-PPNH2NH3+P为蛋白质，是具有两性的胶体物质。它呈酸性或碱性与环境的PH值有关，如溶液的PH值小于该蛋白质的等电点则此溶液对该种蛋白质即为酸性，蛋白质就带正2电，将被酸性染色剂所着色。反之，溶液的PH值大于蛋白质的等电点，则此溶液对该蛋白质来说即为碱性,蛋白质带负电，将被带有阳离子的染色剂所浸染。在日常工作中，长久固定于甲醛的组织切片，往往染色不良，尤其是核的着色欠佳。这是因为固定液甲醛氧化生成甲酸，组织亦随之变为酸性，所以不易被苏木素所着色，补救的办法是，先用流水冲洗组织块，然后用碱性溶液如稀氨酒精等处理使之中和，恢复正常PH值后再进行染色。大多数染色的原理至今仍未搞清楚。有些可能是物理的，有些可能是化学的，有些则可能两种机制都起作用，正因为人们对染色的原理还没有完全掌握，所以目前还不能很好地运用原理来控制它。在相当程度上要凭借工作经验。因此“染色”成为技术性很强的一项工作。在进行每一种染色方法时，必须注意不断地有意识地去积累经验，从成功与失败中去真正掌握该染色技术。三．进行性染色和退行性染色组织成分着色由浅至深，当达到所需要的强度时，终止染色。这种方法称为进行性染色。一般所采用的染液浓度较低，染色过程中应该不时在镜下观察以进行控制，这样才能得到染色强度适中的效果。此种方法无需“分化”，例如，卡红染色。退行性染色，则是先把组织浓度过度，超过所需的程度，然后再用某些溶液脱去多余的染色剂，以达到适当的深度，并使不应着色的组织细胞脱色，这个步骤称为“分化”。在分化中进行镜下观察，当然也是必不可少的。H.E染色中用苏木素染核就是退行性染色。四．直接染色，间接染色和媒染剂有些染色无需第三种物质参加，染色剂和组织即可直接结合着色，是为直接染色。直接染色最后达到的深度与染液的浓度和组织细胞对染色剂的亲和力相关。还有一些染色，单独燃料本身的水溶液或酒精溶液，几乎不能与组织细胞结合或结合的能力很弱，必须有第三种成分——媒染剂参与，才能使染色剂与组织细胞有效地结合起来，这种染色方法称为间接染色。媒染剂通常是双价或三价金属如铝，铁的硫酸盐或氧化物。媒染剂有的加在染液中，媒染作用在染色的同时进行（如Ehrlich氏苏木素染色）；有的则用于染色前，媒染剂单独配成溶液，固定液本身就起着媒染的作用（如Wallory氏磷钨酸苏木素染色用Zenker或Helly氏固定）；有时则用于染色后。媒染剂在染色中起着架桥作用，既能与染料结合又能与组织相结合，达到了促进染色的效果。例如苏木素就需要明矾作媒染剂，才能使组织着色。媒染剂往往在一些间接染色反应中几乎是必不可少的。五．促染剂用以加强染料和组织细胞结合能力的物质称为促染剂。如染胞浆时伊红液中滴加的冰醋酸，有加强其染色作用，增加了有色酸对蛋白质碱基的结合力。促染剂与媒染剂不同，有时为了加快染色过程，可在染液中加入接触剂促进染料与组织细胞着色，但其本身并不参与染色反应。促染剂有如化学反应中的催化剂，少量存在就有明显的促染作用。它们的作用机制也许是降低表面张力或是改变了染液的PH值.六．分化剂在退行性染色中，附在组织细胞上多余的染色剂需用某些特定的溶液把目的物以外的部分脱去，从而使目的物与周围组织形成鲜明的对比，同时使目的物本身的色泽也深浅适当。这种选择性地除去多余染色剂的过程称为“分化”，所使用的溶液即是“分化剂”。分化剂大致可归纳为三大类：3（一）酸性分化剂：如冰醋酸和盐酸。它们能与媒染剂（金属）相结合形成可溶性盐类，从而打开了媒染剂和组织细胞的结合，使组织细胞脱色，另外，它能分解和防止形成染料的沉淀色素。如Ehrlich氏苏木素液当酸性时，溶液为褐红色，正是由于色素根来与铝化合成兰色的“沉淀色素”，之故，一旦将切片投入碱性溶液，则组织立刻呈现蓝色，说明沉淀色素已经形成，但若以1%盐酸酒精分化，则又恢复了红色，此即表示沉淀色素又被溶解。（二）氧化分化剂：其作用实际上是种简单的漂白，如苦味酸，铬酸，重铬酸钾，高铁氰化钾和过锰酸钾等，这些都是一些氧化剂，可将组织上所有的染色剂无选择地氧化而呈无色，犹如漂白作用。但由于这种氧化作用的速度较慢，首先脱去的必是染色较浅的，染色较深的组织细胞还可保留部分染色剂，这样就达到了分化的效果。（三）媒染分化剂：媒染剂能促使组织细胞和染色剂相结合。如果将已染色的切片再放到媒染剂的溶液中，则可使已经和组织相结合的染色剂脱去，这是媒染剂的另一种功能。从这个角度看，又可称之为“媒染分化剂”。它对组织既能使染料附着，又能脱去染料，二者初看似乎矛盾，其实不然，这是因为染色剂和媒染剂的比例关系不同，当溶液中媒染剂的量超过了染色剂的量时，占有压倒优势的媒染剂就把已经和组织细胞相结合的染色剂夺取过来，使组织细胞脱色，即为分化现象。当然，含染料较少的组织必然先被脱色，而着色较浓的组织随着分化时间的控制，即可保留必要的颜色，从而达到分化的目的。既然分化剂有脱色的作用，因此分化剂本身也是脱色剂。一张褪色的切片，需要再染时，第一步就是用脱色剂加以处理。在常规染色中，分化剂必须严格掌握，再根据经验进行镜下观察，控制染色效果。七.变色反应和正色反应大多数染料可将组织染成同一颜色的不同深度；例如：酸性品红总是将组织染成不同色调的红色。淡绿染成不同色调的绿色。这些染色反应最后目的所呈现的颜色和染色剂的颜色相同，称为正色反应。然而有些组织成份可被煤焦类，某些碱性染料染成与染料不同的另一种颜色；如黏液用甲苯胺蓝可染成红色，而其余组织则染成不同色调的蓝色。此种染色反应最后目的物所呈现的颜色和染色剂当初的颜色不同，则称为变色反应。也叫做异染现象。这种组织称为显示异染性，这种染料叫做异染染料。显示异染现象的主要组织成分有黏液，软骨和肥大细胞颗粒。第二节染色剂染色的化学基础作为一种生物染色剂，必须同时满足两个要求：具有鲜艳透明的颜色，而且能与组织细胞相结合。染色剂分子能够显示颜色的基因，称为发色团。主要的发色团有：—N=N，—N=O，C=O，C=C偶氮基亚硝基羰基烯基亚硝基和偶氮基显示的颜色较强，在染色剂中有一个这样的发色团，就可染出颜色。其他的发色团则不是这样，必须有几个发色团，有醌的分子中就有四个发色团，（2个羰基2个烯基）。大量的合成染料都是由煤焦油蒸馏得到的，它们都是苯的衍生物，所以苯环是合4成染料的基础。苯本身是无色的，但其氢原子为某发色团取代后就带有了颜色。含有发色团的苯环化合物，称为色原。苯+发色团=色原色原还不能很好地与组织细胞相结合，即使着了色也很容易脱去。因此仅仅具有色原还不能成为染色剂，染色剂分子中还需具备促使染色剂与组织细胞相结合的基因，这样基国在称为助色团。如—NH2—COOH—OH—SO3H氨基羧基羟基磺酸基氨基在溶液中形成阳离子（+），为碱性；其它羟基，羧基和磺酸基皆带阴离子（-）故为酸性。如三硝基甲苯是个色原，它虽有发色团—硝基，但因缺乏助色团，所以没有染色作用，不能称为染料。假如三硝基苯分子中的一个氢原子被羟基置换，则所生成的化合物既具有发色团而又得到了助色团—羟基，这就成了常用的酸性染料苦味酸。这就可以看出，助色团的作用在于使色原形成盐类，可以在溶液中电离成为带电的离子，这样才能与相应的组织细胞的成份相结合。第三节染色剂的分类一、按来源可以分为1.天然染色剂：主要是苏木素，胭脂红，地衣红，番红花。2.合成染色剂：是从煤焦油中提取的苯衍生物。在生物染色中还使用一些无机化合物，如硝酸银，氯化金，磺，锇酸，高锰酸钾等。二、按主要用途分为1.胞核染色剂：苏木素，胭脂红，甲苯胺蓝，美蓝，孔雀绿等。2.胞浆染色剂：伊红，淡绿，橘黄G,酸性品红,苦味酸等。3.脂质染色剂：苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ，苏丹黑，硫酸尼罗蓝及油红等。三、按染色剂分子中的发色团可分为九类1.亚硝基类：发色团为亚硝基（-NO)如萘酚缘-B。2.硝基染料：发色团是硝基（-NO2）如苦味酸。3.偶氮类：发色团为偶氮基（-N=N-）属于这一类的染色剂的橘黄G,刚果红,俾士麦棕和许多苏丹类的脂质染色剂。4.醌亚胺类：这类染料含有两个发色团，一个是印胺基（-N=），一个是醌型苯环，如硫堇，美蓝，甲苯胺蓝O,硫酸尼罗蓝,中性红,碱性藏红花O，焦油紫等。5.苯甲烷染料：发色团是醌型苯环，如孔雀缘，浅绿，碱性品红，酸性品红，结晶紫，甲基缘等。6.山叮染料：发色团是醌型苯环，如派罗宁，伊红Y等。7.蒽醌染料：此类染色剂含有色原蒽醌，如茜素和胭脂虫酸。8.噻唑类。9.喹啉类。8，9类染色剂使用极少。四、按染色剂的化学性质分类染色剂的干粉是稳定的盐类，它们在溶液中则电离成酸性或碱性染色剂。如酸性5染色剂，能够产生氢离子（H+)或其它阳离子(Na+),而其本身成为带负电荷的阴离子者。这类染色剂一般用于染细胞浆，如伊红Y，苦味酸，橘黄G等。碱性染色剂，能产生氢氧根离子（OH--)或其它负离子(如Cl-),而本身成为带正电荷的阳离子者。这类染色剂常用于染细胞核,如碱性品红等。1.酸性染色剂：色原——助色团——Na→[色原-助色团]+Na+。常用的如伊红，酸性品红，苦味酸，橘黄G，刚果红，水溶性苯胺蓝，淡绿等酸性染料常用以染细胞浆等碱性成份。2.碱性染色剂：色原——助色团——Cl→[色原-助色团]++Cl。常用的如苏木素,卡红,次甲基蓝,甲苯胺蓝,硫堇,美蓝等碱性染料常用以染细胞核等酸性成份。严格地说，酸性染色剂的溶液并不一定呈酸性。同样，碱性染色剂的溶液也未必呈碱性。所谓酸性和碱性染色剂仅指它们电离后其分子的主要染色部分是阳离子还是阴离子。因此称为阳离子型染色剂或阴离子型染色剂更为适当。常规H.E染色中苏木素染液的PH值约为7，此时胞核的化学成份