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第十章细胞增生和凋亡的分子机制多细胞生物体细胞命运•细胞周期增生•分化成具有特定功能的细胞•死亡并从生物体中消失体内自发的细胞死亡是细胞凋亡第一节生长因子信号转导活化细胞周期进程是细胞增生的分子机制细胞周期参与细胞周期的蛋白质调控蛋白协同作用调控细胞周期生长因子通过信号转导调控细胞周期细胞周期:大多数真核细胞经过一系列有序事件，使细胞体积增大，染色体复制，并且分裂成两个各含有一套完整的染色体的子代细胞细胞周期：四个周期间期(G1期S期G2期M期):蛋白质合成旺盛，DNA复制2nG1细胞4n的G2期细胞细胞体积增大M期细胞分裂4n的细胞分裂为两个2n的G1期细胞细胞周期中的四个关卡1.G1晚期的限制点2.G1-S转折的DNA损伤关卡3.G2-M转折的DNA损伤关卡4.M期的有丝分裂中期关卡或称纺锤体组装关卡关卡是调控细胞周期的位点为保持细胞周期正常进行，细胞周期中存在四个关卡：G1晚期的限制点；G1-S转折和G2-M转折的DNA损伤关卡；M期的有丝分裂中期关卡或称纺锤体组装关卡二、有许多蛋白质参与调控细胞周期进程周期蛋白（CYCLIN）周期蛋白依赖性激酶（CYCLINDEPENDENTKINASES(cdk)周期蛋白－周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）RB及E2F－DP1转录因子调节Cdk磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和磷酸酶泛酸（ubiquitin)和使蛋白质泛酸化(ubiquitination)的酶(一)周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶复合物驱动细胞周期进程周期蛋白--含量随着不同细胞周期时期升高和降低的蛋白质，可分为A、B、C、D、E等周期蛋白的含量受以下几方面的调控：生长因子诱导的基因表达泛素介导的蛋白质降解在细胞核与细胞质间的运输（周期蛋白B）周期蛋白的结构有结构保守的100多个氨基酸残基的周期蛋白盒，是与Cdk结合的部位周期蛋白与相应的Cdk结合成异二聚体周期蛋白依赖性激酶（Cdk）组成型表达的核内丝－苏氨酸蛋白激酶单独存在的Cdk无活性与相应的周期蛋白结合后变构形成异二聚体，并被磷酸化和去磷酸化调控才能在有活性和无活性状态之间转换。周期蛋白是调节亚基，Cdk是催化亚基有活性的Cdk能磷酸化底物蛋白质如Rb蛋白，转录因子、组蛋白等，调控它们的活性，驱动细胞周期进程Cdk复合物的活性受CKI抑制ThemainhumancyclinsandCdksCylinCdkFunctionD1,D2,D3Cdk4,Cdk6G1progressionE,ACdk2G1-Stransition,S-progressionB,ACdk1G2-Mtransition成熟促进因子（mature-promotingfactor,MPF)周期蛋白B和Cdk1(Cdc2)的复合物Cdc2istheproteinthatencodedbygeneswhicharerequiredforpassagethroughSTARTaswellasforentryintomitosis.CyclinBisaregulatorysubunitrequiredforcatalyticactivityoftheCdc2proteinkinase.(二)CKI抑制Cdk及周期蛋白－Cdk复合物的活性CDK抑制物（CKI）的种类(两类）1.Cdk4和Cdk6抑制因子家族，包括P15、P16、P18和P19蛋白特异地识别和结合Cdk4或Cdk6，抑制周期蛋白D与Cdk4或Cdk6地结合与周期蛋白D－Cdk4/6结合，抑制Cdk4/6利用ATP磷酸化底物2.Cip/Kip（细胞因子诱导地蛋白/激酶相互作用蛋白）家族，包括P21、P27和P57是细胞接受到接触抑制、DNA损伤、低氧及某些细胞因子等信号后的产物和周期蛋白－Cdk复合物结合，抑制它们的活性对周期蛋白D－Cdk4/6有正调节作用（三）Rb蛋白与转录因子E2F－DP1的结合对G1期进展产生负调节作用RB家族的成员RB（P105RB，视网膜母细胞瘤蛋白）及P107和P130分子中有一个口袋状结构，称口袋蛋白RB家族的分子中口袋蛋白能与多种蛋白结合，如转录因子E2F－DP1复合物、RNA聚合酶等，并调控它们的活性G1早期低磷酸化的RB与E2F－DP1复合物结合，抑制它的转录因子功能G1中期及晚期，周期蛋白D－Cdk4/6和E/Cdk2先后磷酸化RB，磷酸化的RB失去活性，释放出E2F－DP1游离的E2F－DP1活化靶基因转录核苷酸及DNA合成酶的基因，如四氢叶酸还原酶，胸苷激酶，DNA合成酶α的基因周期蛋白D、E、A及Cdk2基因某些细胞癌基因游离的E2F－DP1活化靶基因转录E2F基因本身E2F活化自身基因及周期蛋白E，加速RB蛋白在G1晚期磷酸化及释放E2F－DP1E2F靶基因的表达使细胞完成DNA复制的准备，细胞通过限制点（四）使Cdk磷酸化和去磷酸化的酶也调节Cdk活性Cdk1101位苏氨酸被Cdk活化激酶磷酸化，可将活化15位酪氨酸及14位苏氨酸磷酸化，失去活性G2期，三个部位都磷酸化，无活性15位酪氨酸及14位苏氨酸去磷酸化后，才能有活性(五)泛素－蛋白酶体介导蛋白质降解也起调节细胞周期的作用泛素（Ub）是由76个氨基酸残基组成的多肽，高度保守，广泛存在于所有真核细胞内Ub利用其末端甘氨酸末端残基与靶蛋白的α或ε－氨基结合，使蛋白质泛素化标记，以便于进一步降解Ub与靶细胞的结合由一系列酶连续催化完成泛素活化酶（E1）泛素偶联酶（E2）泛素－蛋白连接酶（E3）蛋白质泛素化过程所需要的酶：泛素活化酶E1和泛素偶联酶E2都是巯基酶，参与酶催化反应泛素－蛋白连接酶E3是多亚基酶，有两类：SCF复合物APC（有丝分裂后期促进复合物）SCF复合物三个核心成分（Skp1、Cdc53/Cullin和F－box）底物先被磷酸化，才能和F－box蛋白结合Cdc53/Cullin和另一亚基R－box蛋白结合泛素化的E2，并催化泛素和底物连接SCF复合物的底物有周期蛋白D、E、P21、P27、E2F和WeelAPCAPC由10种以上的亚基组成，能与E2结合的泛素转移给周期蛋白A和B。有功能的纺锤体形成后，APC也能多泛素化连接姐妹染色体的蛋白通过多泛素化途径降解的蛋白质都是一些短命的蛋白质，如周期蛋白，P21,P27,E2F,Weel等与周期蛋白泛素化有关的序列周期蛋白A和B的N端9个氨基酸残基组成的保守序列，称破坏蛋白盒周期蛋白D和E的C端保守的PEST（脯－谷－丝－苏）序列过程1.E1利用ATP水解释放能量活化Ub，使半胱氨酸残基与Ub的C末端甘氨酸残基间形成高能硫酯键2.E1将活化的Ub传递给E2，形成Ub－E2中间体E2是一类小分子量蛋白质，含有一个保守的核心结构域，其中的半胱氨酸与Ub也以高能硫酯键相连3.在E3的催化下，Ub的C末端与靶蛋白的赖氨酸残基的ε－氨基以一个酰氨异构肽键连接，形成泛素化蛋白质4.泛素化蛋白Ub分子上的48位赖氨酸残基的ε－氨基进一步不断泛素化，形成泛素化蛋白质三、调控蛋白协同作用调控细胞周期(一)Cdk4/6和Cdk2的活化是限制点处调控的关键因素•细胞周期蛋白D最早出现于G1中期，在晚期达到高峰•细胞周期蛋白E最早出现于G1晚期，在G1-S转折处含量最高•周期蛋白D和E分别与Cdk4/6和Cdk2形成复合物，使Rb磷酸化释放转录因子，使靶基因转录，作好复制准备•周期蛋白D和E经SCF泛素化而降解（二）Cdk1活化是G2M关卡处关键调控因素•周期蛋白B-Cdk活化•周期蛋白B磷酸化使周期蛋白B-Cdk1在核内聚集，并磷酸化底物蛋白，使染色体致密化，核膜解体，纺催体形成（三）APC介导的多泛素化蛋白降解是细胞离开M期进入G1期的关键调控因素•周期蛋白A/B-Cdk1是APC磷酸化而活化的因素之一•有丝分裂中期介导姐妹染色体稳定地附着在纺锤体的有蛋白激酶和蛋白质因子•APC活化导致连接姐妹染色体地蛋白质降解，细胞通过有丝分裂中期关卡，可进展到G1期（四）DNA损伤关卡与G1及G2期停滞相关G2期地停滞涉及一系列的磷酸化过程（四）生长因子等细胞外因素通过信号转导调控细胞周期•细胞退出细胞周期，从G1期进入G0期，可由以下因素引起环境中的信号分子促进G1期细胞退出细胞周期，并开始分化环境中启动细胞分裂的生长因子不足体外培养的原代细胞在分裂一定次数后进入衰老状态，不能回到G1期的终末G0期。G0期的细胞仍然进行着新陈代谢，许多具有特定功能的G0期细胞甚至不停地合成及分泌蛋白质，如胰腺细胞、肝细胞G0期重返G1期要经过三个阶段获得资格进入需要血小板源生长因子表皮生长因子和胰岛素进展需要胰岛素样生长因子1最终活化周期蛋白－Cdk复合物，从而使细胞从G0期进入G1期G1期的细胞也需要生长因子促进细胞周期的进程生长因子受体酪氨酸蛋白激酶及整合素Ras-Raf-MAPKK-MAPK/ERK途径周期蛋白D的表达进入胞质被降解(G1早，中期）生长因子活化p21和p27促进周期蛋白D和cdk4/6结合使少量RB磷酸化E2F－DP1促进周期蛋白E和Cdk2的表达第二节细胞凋亡是一种自发的程序化细胞死亡•早在1972年Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有二种死亡形式,一种是早被熟知的细胞坏死（Necrosis），另一种是新提出的程序性细胞死亡（Programmedcelldeath,PCD）学说。但该学说到九十年代初才进入研究高潮，进展极快，现在普遍称之为细胞凋亡（Apoptosis）•细胞凋亡是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的程序化死亡过程•是一个由基因调控的细胞主动结束生命的过程细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）PCD最初是1956年发育生物学中提出的概念，是个功能性概念，强调的是其分子生物学和生理功能，一般指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。形态学特征凋亡的起始：细胞器、染色质等开始变化凋亡小体的形成：质膜包裹染色质和细胞器凋亡小体的消化：被吞噬细胞消化生物化学特征•胞浆内Ca2+浓度升高。细胞内活性氧增多。质膜通透性变大。•DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成180~200bp为基数的有序片段。Ⅱ型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶（Calpain）活性升高。细胞凋亡的生理意义确保正常发育、生长维持内环境稳定发挥积极的防御功能细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡可能会引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为自然科学界的关注热点。凋亡途径是由诱导产生的胱天蛋白酶级联反应•凋亡途径最早在线虫中阐明凋亡途径涉及四个ced基因产物：Ced4蛋白是一种蛋白酶，能活化Ced3蛋白Ced3蛋白是一种蛋白酶，能使许多底物蛋白降解，从而出现凋亡形态学变化Ced9蛋白，能使Ced4蛋白失活线虫胚胎期Ced9基因突变失活能使许多本应存活的细胞由于Ced4和Ced3的活化而凋亡，结果胚胎死亡。Egl-1的产物能抑制Ced9，过量表达可诱导凋亡•胱天蛋白酶的名称来自该酶的活性中心有催化作用的半胱氨酸残基，能水解底物蛋白中特异部位的天冬氨酸残基羧基侧肽键•凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf1）是一种构架蛋白，能活化胱天蛋白酶•Bcl－2家族中有些成员是抗凋亡的，另一些成员是促凋亡哺乳动物中Caspase家族成员有相似的结构与活化过程有14种家族成员以酶前体的形式合成前体的结构分三部分：N端的原域，中间的p20和C端的p10域。域与域之间有可以被胱天蛋白酶水解的位点在活化过程中，前体被水解成3个域，原域丢失，2个p20域和2个p10域组装成含有两个活性中心的四聚体成熟酶胱天蛋白酶分类1.起始者胱天蛋白酶，如caspase8,9和10位于上游，有较长的原域，和接头蛋白或构架蛋白相互作用的功能域通过蛋白质－蛋白质相互作用自我激活Caspase8前体位于途径上游，在接头蛋白FADD的介导下从胞