第十章高新技术在生物医学研究中的应用

第十章高新技术在生物医学研究中的应用20世纪末5年间，在人类健康研究中有51项突破性成果，其中22项是通过实验动物模型遗传研究获得的。自1980年第一个转基因小鼠诞生以来，转基因技术在实验动物科学领域得到广泛应用，被称为实验动物科学的一场革命。现代生物技术工程手段包括：胚胎工程技术、转基因技术、细胞核和细胞器转移技术、基因导入技术、克隆技术等。第一节胚胎工程技术胚胎工程研究对LA的遗传育种、种质保存、良种扩群及培育具备相同遗传特性的动物群（超纯系）具有实际应用价值和理论意义。基本内容包括人工授精、同期发情、超数排卵、胚胎培养、胚胎保存、胚胎移植、胚胎分割、体外受精、显微受精、性别控制、基因转移、胚胎嵌合、胚胎干细胞、细胞核移植、卵母细胞激活与孤雌发育等。一、胚胎干细胞和成体干细胞1、干细胞具有自我更新能力（self-renewing），能够产生高度分化的功能细胞。按生存阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。2、胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES细胞）是一种存在于胚胎早期的全能细胞，能分化为体内各种类型的组织细胞，可长期增殖培养并保持高度未分化状态。1）最大特点是体外ES细胞既像培养的一般细胞可扩增、遗传选择操作和冻存等，而不失潜能性。在一定条件下，ES细胞可被诱导分化为各种细胞、组织，也可与受体胚胎嵌合，生产出包括生殖系统在内的各种组织的嵌合体后代。因此，ES细胞既是研究哺乳动物早期胚胎发生、细胞组织分化、基因表达调控等发育基础研究的理想模型系统和有用工具，也是进行动物胚胎工程、转基因动物、家畜育种、临床医学研究和应用的重要途径。2）建立ES细胞系的原始ES细胞主要来源：发育为桑椹胚的胚胎细胞、胚泡内层细胞团和早期胚胎的原生殖细胞。桑椹胚细胞和胚泡内层细胞可通过体外受精和培养的方法获得，原生殖细胞主要从早期流产胎儿的性腺脊分离而得。3）建立ES细胞的方法：通过机械分散和酶消化法得到单ES细胞悬液，先在改良Eargle,s培养液中培养2~3天，再转到经放射线照射或丝裂霉素处理的成纤维细胞饲养层上进行传代培养。为维持ES细胞在未分化状态增殖，需在培养液中加入细胞分化抑制因子。4)从体外培养体系中除去饲养层和分化抑制因子，ES细胞可模拟体内正常胚胎的发育过程，分化为含有多种组织细胞的胚胎体。若加入某些细胞诱导分化因子和化学诱导剂，可使ES细胞向特定细胞方向分化。小鼠的ES细胞可在体外定向诱导分化为神经细胞、造血细胞、心肌和肌肉细胞、内皮细胞和血管、软骨细胞等。人的ES细胞系的建立是人类生物学研究的重大技术突破，研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。5）优势在于ES细胞能降低免疫反应。ES细胞表面抗原少，不会诱发严重的免疫反应，机体不会对外来“入侵者”产生排斥。6）ES细胞应用新进展：美国BID医学中心于2001年发现胚胎干细胞能修复心肌细胞，为充血性心力衰竭（congestiveheartfailure,CHF）患者的治疗带来新希望。日本京都大学科学家采用电刺激方法把老鼠的胚胎干细胞和淋巴细胞融合成为一个细胞，发现它能分化为软骨、肌肉和神经等特定组织的体细胞，并具有增殖能力。这一技术有可能促进再生医疗技术的发展。日本信州大学田川阳一等人使用老鼠的胚胎干细胞培育肝细胞获得成功，为肝病患者带来希望。西北农林科技大学专家于1996年从小鼠胚胎干细胞分化得到心脏跳动样细胞团，1997年由流产胎儿分离克隆出人类胚胎干细胞，现传至9代，2001年9月由窦忠英教授等人第六次从人类胚胎干细胞中分化诱导得到心脏跳动样细胞团。3、成体干细胞：被移植入受体中表现出很强的可塑性。通常供体干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞，但也有例外。1999年Goodell等人分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养5天后，与少量骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系，这种现象被称为干细胞的横向分化。调控机制目前不清楚。大多数观点认为干细胞的分化与微环境密切相关。成体干细胞打破了用于临床治疗的干细胞只能来源于胚胎或受精卵的限制，为干细胞治疗疾病提供了新途径。二、超数排卵(superovulation)：经外源激素处理的雌性动物可改变性周期，可超常数的排卵，甚至可以超常数十几倍。如1只家兔88枚胚胎，1只KM小鼠83枚胚胎。实际意义：在生产和科研中可获得大量卵或胚胎，可提高动物繁殖数量，提高产量，增加经济效益，满足胚胎工程研究、遗传工程研究和建立胚胎库的需要。用于超数排卵、同期发情的激素：促卵泡激素FSH和促黄体激素LH、孕马血清促性腺激素PMSG和人绒毛膜促性腺激素HCG。三、胚胎培养(embryoculture)：在体外仿造类似于体内条件的环境，使胚胎在体外得到与在体内一样的正常发育。适宜的培养体系是动物胚胎生物技术、体外受精、胚胎分割、胚胎克隆、胚胎嵌合、外源DNA注射的基础条件和有效工具。共培养体系是指把胚胎放在输卵管上皮细胞或其它类型的辅助细胞（哺乳动物的子宫内膜细胞、颗粒细胞、卵丘细胞，非洲绿猴肾细胞及肝细胞等）上共同培养，以促进胚胎发育。输卵管上皮细胞共培养系统可明显促进早期胚胎体外发育，并提高胚胎发育质量。四、胚胎分割、胚胎移植和胚胎保存1、胚胎分割(embryosplit)技术就是将未着床的早期胚胎用显微手术的方法一分为二、一分为四或更多次地分割，以成倍地获得胚胎数量。将分割的胚胎分别移植入受体内妊娠产仔，可克隆出遗传性能完全一样的后代。目前用胚胎分割法已克隆出小鼠、家兔、山羊、绵羊、猪、牛和马等。2、胚胎移植胚胎细胞核移植：用显微手术的方法分离未着床的早期胚胎细胞，将其单个细胞导入除去染色体的未受精的成熟卵母细胞，经过电融合，让该卵母细胞质与导入的胚胎细胞核融合、分裂、发育为胚胎，把胚胎移植给受体，让其妊娠产仔。克隆出小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴。体细胞核移植：把动物体细胞经过抑制培养，使细胞处于休眠状态，采用以上核移植方法，将其导入除去染色体的成熟卵母细胞克隆胚胎，移植给受体，妊娠产仔，克隆出动物。如绵羊“多利”、小鼠、兔、山羊、猫、猪、牛、马骡等。3、胚胎保存(embryopreservation)：应用超低温冷冻技术保存胚胎。美国杰克逊实验室和美国国立卫生研究院（NIH）分别冻存500多个和140多个品系的小鼠胚胎。左琴等人用玻璃化冷冻技术保存近交小鼠的胚胎，解冻后胚胎培养发育率达87%~90%。分割和保存的主要意义是能够使优秀品种品系（包括珍稀和濒危动物）的种质长期保存，防止基因丢失，并且随时复苏。五、胚胎嵌合：把两枚胚胎细胞（同种或异种动物胚胎）嵌合，共同发育成为一个胚胎，即嵌合胚胎，再移植给受体，妊娠产仔，这种技术称为胚胎嵌合。若该仔具有以上两种动物胚胎的细胞，则称为嵌合体动物。如1984年英国绵山羊的培育成功、2000年中山医科大学陈系古培育成功黑白相间的嵌合体小鼠等。总而言之，克隆哺乳动物的方法如下：胚胎分割、胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植、胚胎嵌合、体细胞核移植等。第二节转基因动物1982年转基因“超级小鼠”的诞生，是遗传学研究具有里程碑意义的事件。1991年第一次国际基因定位会议认为转基因动物技术是遗传学继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术，被列为生物学发展史上126年中第十四个转折点。一、转基因动物的概念转基因动物(transgenicanimal):指借助基因工程技术将确定的外源基因通过生殖细胞或早期胚胎导入动物个体的染色体上，在其基因组内稳定整合并能将导入的外源基因稳定地遗传给后代的一类动物。简言之，转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。二、转基因动物研究的意义及应用1、转基因动物是对多种生命现象本质深入了解的工具。如研究基因的结构与功能的关系、细胞发育的潜能性、细胞核与细胞质的相互关系、胚胎发育调控、肿瘤、神经与发育等。2、可用来建立多种疾病的动物模型，进而研究这些疾病的发病机理及治疗方法。如代谢病高歇氏(Gaucher)病转基因小鼠的应用。3、转基因动物技术可由于改造动物的基因组而改良其经济性状，提高经济效益。4、转基因动物可作为医用或食用蛋白的生物反应器。如转基因山羊抗凝血酶III、转基因绵羊1-抗胰蛋白酶、转基因兔的-葡萄糖苷酶。5、通过转基因动物可以生产人体或动物进行器官或组织移植时所需的器官和组织。如家畜胎儿神经细胞可替代人类神经细胞用于帕金森症的治疗。第三军医大学西南医院将转基因乳猪皮用于皮肤移植。猪器官的体积和形状以及DNA基本与人类相似，是理想的肾、心、肝等器官供应者，但存在免疫排斥，可通过转基因技术和克隆技术培育大量不含免疫排斥的转基因克隆猪的器官。三、转基因动物研究进展1、英格兰罗斯林研究所(Roslin)1997年成功培育转基因绵羊，其乳汁中含有人的凝血因子IX，用来治疗血友病；含有的-抗胰蛋白酶可治疗北美肺气肿。2、日本培育的转基因鸡含有白血病阻止因子，可能成为生产抗癌药品的“动物工厂”。3、湖北省农科院魏庆信研究员2000年培育转基因猪，能合成人血清白蛋白，为治疗因失血、创伤、癌症等引起的休克、水肿等提供医用血清白蛋白开辟了新途径。4、华中农业大学和中国农业大学合作，用转基因小鼠乳腺表达人瘦蛋白的研究。5、用转基因技术生产的基因工程小鼠已经达到很高的水平。如将特定的外源基因插入小鼠的基因组，可得到转基因小鼠(transgenicmice)；将小鼠的基因组中特定内源基因定点突变，可得到基因剔除小鼠(geneknockoutmice)；将小鼠的基因组中特定内源基因进行定向重组，可得到基因替换小鼠(geneknockinmice)。为医学研究提供了丰富的动物模型。如BALB/C-HSF1用于热休克研究、Smad3用于研究粘膜免疫缺陷和骨性关节炎等。6、转基因研究已经渗透到医学、遗传学、发育生物学、畜牧学等领域。四、转基因动物途径1、受精卵原核显微注射和育种•以单细胞期受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建时的载体DNA直接注射入受精卵的原核，并将受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育，获得转基因动物个体。2、胚胎干细胞（ES细胞）介导的基因转移和育种•利用电穿孔等基因转移技术，将载体DNA转入ES细胞，经过囊胚腔注射，使ES细胞与受体囊胚细胞混合，并移植入假孕母体子宫，继续发育产生嵌合体。3、体细胞基因转移和克隆•将体细胞的细胞核移入去核的卵细胞中，并将所得细胞移入代孕动物，获得转基因动物。4、精子介导的基因转移和育种•交精子细胞与转基因载体DNA混合共浴后，将精子头部直接注射入卵细胞，经过人工授精的受精卵移入假孕母体继续发育，获得转基因动物。五、存在的主要问题及研究重点在克隆技术尚不可能推广应用的时候，针对转基因整合的随机性问题、ES细胞育种的效率低等问题，建立向动物基因组引入点突变、基因重复突变或条件性突变等精确修饰基因组的策略。1、通过提高ES细胞体外培养技术以及观察研究ES细胞体内分化规律及其影响因素，来提高ES细胞生殖系嵌合能力。如构建高效表达报告基因（绿色荧光蛋白，GFP）的载体，以电穿孔方式转入ES细胞，筛选阳性ES细胞转入小鼠囊胚，比较分析ES细胞移入不同的胚胎发育期的实验结果，获得了嵌合体小鼠。2、基于次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthineguaninephosphoribosyltransferase,hprt)基因位点的转基因定点整合系统的建立。3、向基因组中引入点突变的基因打靶研究：精确再现自然界的基因突变，具有重要实际意义。如血友病B模型的建立。4、诱导性突变和引入基因重复的基因打靶研究：对组织特异性表达的基因功能及基因的数量性状研究意义重大。谢谢