瘦肉精在大鼠体内的代谢.

克仑特罗在大鼠体内的代谢目录1瘦肉精简介2摘要3实验材料和方法4结果分析与讨论瘦肉精简介理化性质：通常我们所说的瘦肉精是指克伦特罗(Clenbuterol)，学名为盐酸克仑特罗，简称克仑特罗，又名克喘素、氨哮素、氨必妥、氨双氯喘通。为白色结晶状粉末，味略苦。结构简式：分子式：C12H18Cl2N2O理化特性：白色或类白色的结晶粉末，无臭、味苦，熔点161℃，溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。当盐酸克林特罗以超过治疗剂量5-10倍的用量用于家畜饲养时，即有显著的营养“再分配效应”——促进动物体蛋白质沉积、促进脂肪分解抑制脂肪沉积，能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率，因此曾被用作牛、羊、禽、猪等畜禽的促生长剂、饲料添加剂。1ug/mL的盐酸克伦特罗添加于猪饲料中用于促生长，人食用猪肝或猪肺足够引起中毒。世界没有任何正规机构批准克伦特罗作为饲料添加剂用于动物促生长。“瘦肉精”包括盐酸克仑特罗在我国已经被禁用。由于美国人不吃畜禽的内脏，因此允许使用一定量的瘦肉精。摘要本实验研究了14C标记的克伦特罗在雌雄大鼠体内的代谢。喂食每只大鼠200µg/kg体重的14C克伦特罗，并在之后8天期间研究其代谢产物和过程。发现有大约60%的放射性物质（14C）从尿液中排出，雄鼠和雌鼠分别有20%和30%的放射性物质（14C）从粪便中排出。利用HPLC（高效液相色谱法）检测放射性物质（14C）可以对克伦特罗的代谢产物进行鉴定和定量，发现尿液中的一些代谢产物是不稳定的。大部分尿液和粪便中的克伦特罗代谢产物可以使用各种MS（质谱）分析技术进行分离和鉴定。在大鼠被给药后，分析方法也可以建立克伦特罗在粪便和组织中代谢产物长达72h的图谱。克伦特罗的主要代谢过程包括：N-脱烷基化（仲胺），N-氧化和硫酸共轭（伯胺）。另外，对不同性别大鼠的克仑特罗代谢产物中N-脱烷基化比率的差异进行观察。大鼠尿液中检测到的主要代谢产物是4-N-羟胺，而粪便中的放射性物质（14C）大多与氨基磺酸克仑特罗有关。实验材料和方法1.实验试剂：克伦特罗和用于标记的分子[14C]CL[4-氨基-3,5-二氯-α-[（叔丁基氨基甲基）]苄基醇。甲酸、乙酸、解旋酶、VI型硫酸、D型葡糖二酸-1,4-内酯。2.实验动物：8只成年大鼠（4只雄性和4只雌性）。3.实验样品的采集：•大鼠的排泄物的采集：8只成年大鼠被单独饲养在不锈钢笼中。允许大鼠自由饮水并且有一个标准的日常饮食。大鼠的平均重量分别为42721g（雄性）和29924g（雌性）。一周的环境适应期后，每只大鼠被强制喂食200µg/kg体重的14C标记的克伦特罗。后面的8天，每天把尿液和粪便收集起来备用。最后，大鼠被放血致死。鼠笼要单独用500ml的甲醇/水（1：1，v/v）清洗干净，并从中取1ml作为样品做放射性物质测定。取下肝脏，如果不立即使用，这些样品都要储存在-20℃下。•组织样品的采集：4只雄性大鼠（年龄，10周）被安置在如上文所述的环境中。分别在喂食克仑特罗后12h，24h，48h和72h通过放血处死大鼠。切除肝，肺和肾并存储在-20℃下。•盐酸克伦特罗剂量的影响：3只雄性大鼠（年龄，10周）被安置在如上所述环境中。分别强制喂食5，20，40mg/kg体重14C标记的克仑特罗。3天内，每天收集3次尿液和粪便并储存在-20℃下用于研究。4.仪器设备：主要有HPLC（高效液相色谱仪）、放射性物质检测器、吉尔森模型202馏分收集器、UV（紫外）分光光度计、帕卡德液体闪烁计数器。5.实验过程：•尿液：尿液样品与甲醇混合（1：2，v/v），搅拌，以10000rpm（4℃）离心10min，将沉淀物丢弃，上清液在真空下浓缩并用微孔滤膜（0.5g，0.45µm）过滤，最后用HPLC进行分析。•粪便：通过初步分析这4只大鼠的粪便来确定大鼠组织中瘦肉精代谢产物的概况，目的是判断大鼠粪便中是否存在不稳定或挥发性的克仑特罗代谢产物。冷冻干燥前后的这些粪便样品中的放射性物质含量需要通过完全燃烧和液体闪烁计数器来确定。通过对粪便提取物进行分析，比较新鲜和冻干样品中克仑特罗代谢产物。研究期间将每天收集到的大鼠粪便进行冷冻干燥，然后利用球磨床均质化，再对每个样品中的14C进行测定。将大约0.5g的冷冻干燥样品与甲醇/100mM的乙酸铵混匀2min，pH值3.2（1：6：3，w/v/v），然后在10000rpm下（4℃）离心10min。将沉淀再用相同的溶剂混合萃取两次，再与甲醇/1mM的氢氧化铵（1：6：3，w/v/v）混均萃取一次。放射性物质计数完成后，将4个上清液合并，用异辛烷去脂，并在N2条件下浓缩。将所得提取物在微滤膜（0.5g，0.45µm）下进行过滤，然后利用HPLC进行分析，最后通过燃烧分析来确定离心沉淀中的放射性物质残留。对每只大鼠的2天和3天的粪便以及雌性大鼠4天的粪便分别进行处理并分析，以确定粪便中代谢产物的组成和变化。喂食大鼠较高剂量的克仑特罗并对其粪便进行同样的分析流程。•组织：提取约5g的肝脏组织对肝脏代谢产物进行分析。将样品切成小片，并使用6ml/g的乙腈/甲醇/50mM乙酸铵缓冲液均质化，pH3.2（6：3：1，v/v/v），然后在10000rpm和4℃离心10min。将上清液立即存储在-20℃下，将沉淀物再进行5次萃取，即2次使用同样的溶剂，1次用乙腈/甲醇/50mM的碳酸氢钠缓冲液在pH8.35（6：3：1，v/v/v）条件下进行萃取，最后2次用乙腈/甲醇/1mM的氢氧化钠（6：3：1，v/v/v）进行萃取。最后残留的每个样品的离心沉淀通过燃烧分析测定放射性物质残留。合并上述6个上清液，用乙腈饱和异辛烷去脂，真空浓缩，并在如上所述的条件下过滤，最后用HPLC分析。肺和肾脏中的代谢产物的检测是使用相同的提取方法。肾样品使用前，要用水洗涤两次再进行提取。•酶解：将粗制尿20µl（或2µl纯化代谢产物加入20µl水中）与480µl0.1M乙酸钠缓冲液（pH4.8）和20µl的培养液（即2000菲什曼单位B-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶活性的20000罗伊单位）混合，并在42℃酶解16h。对酶解后的产物进行离心，然后用微滤膜（0.5g，0.45µl）过滤，再用放射性-HPLC进行分析。复测定在相同的条件下进行，不同的是加入了10µlD-葡糖二酸-1,4-内酯来抑制b-葡糖醛酸酶的活性。更具体的是通过对纯化后的代谢产物进行测定，来检测是否有硫化反应的发生。在每个2µl代谢产物样品中加入450µl20mMTris缓冲液和50ml产气杆菌、VI型硫酸酯酶在pH为7.1和37℃的条件下培养16h，然后进行和上文中同样的分析。•尿液中代谢产物的分离：主要有两种方法1.使用HPLC结合馏分收集器进行分离。2.使用C8柱进行分离。结果分析与讨论1.大鼠的代谢平衡。每只大鼠被喂食200µg/kg的克伦特罗，并通过8天的研究发现：雄性大鼠代谢了87.12.5％的14C，雌性大鼠代谢了90.24.2％的14C。放射性物质(14C）主要通过尿液排出，而通过粪便排出的14C比较少（见表1），雌性大鼠尿液中的14C所占比例更高（P0.05）。与雄性大鼠比较，14C通过雌性大鼠尿液的排泄较慢。并且直到第5天（见图1），14C在雌性大鼠粪便中的含量还是比较可观的。在研究结束时，雄性大鼠尸体中残留的放射性物质含量相当于克仑特罗3.620.36ng/g,而雌性大鼠尸体中放射性物质含量只有相当于瘦肉精2.200.62ng/g（P0.05）。大鼠呼出的14CO2占总喂食剂量的比例小于1%。2.尿液中克仑特罗代谢产物的放射性-HPLC分析和定量。由图1可知：在大鼠尿液中检测到14个不同的放射峰。一些峰在采集的新鲜尿液中是从来没有检测到的（或者仅检测到微量）。对被喂食200µg/kg克仑特罗的大鼠的尿液进行放射性-HPLC分析，结果见图2，由此研究克仑特罗代谢产物完整的分布状况。由于尿液在进行分析时，已经在4℃下贮存了24h，因此，化合物M9和M12出现在了色谱图上。如果相同的样品在采集后立即进行分析，它们就不能被检测到。•对大鼠代谢平衡研究期间收集的尿液样本进行了放射性-HPLC分析。表2列出各组动物在被给药后0-24h获得的结果。由表2可知：M5和M11，以及含量较少的M1和M3，是检测到的主要代谢产物。另外，M5是雄性和雌性大鼠的主要代谢产物。第5个代谢物M8占雄性大鼠尿液中放射性物质的15％，而在相同的时间（约26min），雌性尿液中M8的峰区信号却很弱。观察其他代谢物信号的差异，代谢物M2从未在雌性大鼠尿液中被检测到。在这一组中，雌性大鼠未代谢的克仑特罗的比例比在雄性大鼠要（分别为37%和16％，）大得多。•克仑特罗喂给量对大鼠尿液中代谢产物的影响。给3只大鼠单次喂食更高剂量的克仑特罗，在给药后的前96h期间收集尿液样本。在将代谢产物分离前，对这些样品进行放射性-HPLC分析。母体化合物各成分组成和其主要代谢产物在尿液中的总放射性物质含量和计算（见图3）。除了没有被代谢的瘦肉精，M5是被喂食5-40mg/kg克仑特罗的大鼠尿液中检测到的主要代谢产物。另外，M5在尿液中的所占比例较高且含量也很高。•酶解。在雄性大鼠尿液与培养液培养16h后，原来所有检测到的放射性代谢产物M5都转变为克仑特罗。此外，检测不到M7，而增加了相应含量的放射性代谢产物M9。另外，发现代谢产物M5与硫酸混合或与培养液和D-葡糖酸-1,4-内酯混合时会部分或全部转化为克仑特罗，在没有酶参与的相同条件下进行的对照培养试验也获得了同样的结果。3.大鼠粪便中代谢产物的放射性-HPLC分析和定量。初步实验结果表明，冷冻干燥不会引起大鼠粪便中放射性代谢产物的流失，也不会对放射性-HPLC分析的结果产生影响。因此，在对所有收集的粪便利用溶剂萃取前，都可以进行冷冻干燥。冷冻干燥主要是用于放射性水平最高的样品，即雄性大鼠的第2天和第3天的粪便和雌性大鼠2-4天的粪便。本次研究中85％的放射性物质可以在雄性大鼠第2天或第3天的粪便中被发现。结果表明雌性大鼠也有类似的结果（在第3天的粪便中发现86％的放射性物质），并且在2-4天后放射性物质没有显著变化。前两次酸性提取物中的放射性物质含量占总放射性代谢产物的比例始终超过95％。M3是雄性和雌性大鼠粪便中的主要代谢产物。通过放射性-HPLC分析发现，雄性大鼠第3天的粪便中，M3和克仑特罗占总放射性代谢产物的比例分别为67.612.4和28.313.2％。另外，观察到一种（或多种）非常少量的极性代谢产物，峰区有4-5min的停留时间。雌性大鼠粪便中的代谢产物也有相似的组成（见图4），在第3天，雌性大鼠粪便中M3和克仑特罗占总放射性代谢产物的比例分别为78.13.5和15.84.0％。数量有限的M9，M11和极性代谢产物，也在一些提取物中被检测到。对第2和第4天粪便分析后得到了非常类似的结果。喂食大鼠高剂量的克仑特罗并不能改变大鼠粪便中代谢产物的组成和成分。4.组织中放射性物质残留。由图5A可知：肝是靶器官，但在肺和肾脏中也测到显著水平的放射性物质残留。超过48h，所有组织中放射性物质含量迅速下降，但在肝和肺中仍能检测到。肝结合的放射性物质占各组织中总放射性物质的32％（12和24h），39％（48h），和64％（72h）。8天的代谢平衡研究表明：雄性和雌性大鼠肝脏中残留的14C水平分别相当于14.2和12.8ng的克仑特罗当量/g（P0.05）。•大鼠组织中代谢产物的特征。所有大鼠肝脏提取物的放射性-HPLC分析从本质上是相似的。通过观察，除了克仑特罗以外（在放射性物质中，其含量始终在一半以上），具有相同保留时间的两个代谢产物为M10和M13。在给药后48h，肝脏代谢产物M10和M13分别占肝脏组织中放射性物质的32%和17％（见图5B）。一些肝脏样品在进行溶剂萃取之前，加入了已知量的3H标记的N-OH-CL。在这些实验中，整个萃取过程中近100％的3H标记的N-OH-CL还原为克仑特罗，而当使用一种快速的制备方法时，只有