白花蛇舌草中总黄酮的分离提取及含量测定

白花蛇舌草中总黄酮的分离提取及含量测定一实验背景白花蛇舌草(oldenlandisdiffusawilld)原茜草科耳草属植物，广泛分布于我国长江以南地区，含有丰富的黄酮、多酚、有机锗、熊果酸、齐墩果酸、多糖等化合物。民间常用此草药内服治疗小儿疳疾、毒蛇咬伤、咽喉炎、结肠炎、肝炎、肿瘤等，外用治疗疮疖肿毒等症。现代药理学研究表明其具有抗炎、抗菌、增强免疫功能、抗肿瘤的作用。白花蛇舌草总黄酮(totalflavonesofoldenlendiadiffusawilldFOD)是从白花蛇舌草中提取的有效部位，总黄酮含量达56％[1-3]。二实验目的①认识白花蛇舌草中的总黄酮的化学结构与性质，了解白花蛇舌草中活性成分的应用；②设计、优化分离、提取白花蛇舌草中的总黄酮的实验方案；③选择合适的化学或仪器分析方法测定白花蛇舌草中总黄酮的含量。三实验原理总黄酮是指黄酮类化合物，泛指两个苯环通过中央三碳链连接的一系列化合物，是一大类天然产物，总结构式为：如2-苯基色原酮：。有交叉共轭体系存在的大都显色，如二氢黄酮醇无色，而黄酮醇显灰黄-黄色。助色团的引入会使颜色加深，尤其是7，4’引入助色团对颜色的影响较大。总黄酮多为结晶型固体，少为无定型粉末。黄酮苷元多难溶于水，易溶于有机溶剂（甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚）和稀碱液；黄酮苷类可溶于热水、甲醇、乙醇、稀碱液，难溶于亲酯性有机溶剂。黄酮类化合物的酸性来自于酚羟基，其中7，4’位羟基的酸性较为显著。黄酮类化合物在紫外光谱图上有两个吸收带：环肉桂酰系统引起的吸收带(300-550nm)和环苯酰系统引起的吸收带(240-280nm)。若加人铝盐，则铝离子与黄酮化合物形成稳定的配合物，吸收带会明显向长波方向移动(红移)，而且强度相应增加。故，可采用紫外-可见分光光度法进行含量测定。四主要仪器与试剂1.仪器粉碎机，4号筛，天平，恒温干燥箱，色谱柱，紫外-可见分光光度计，250mL锥形瓶，10mL容量瓶，离心机，电炉，冷凝管，水浴锅等。2.试剂白花蛇舌草（干燥），聚酰胺树脂，芦丁标准液，无水乙醇，蒸馏水，1％三氯化铝溶液等。五实验步骤1.白花蛇舌草总黄酮的提取将干燥的白花蛇舌草用中药粉碎机磨成粉末，过4号筛（即65目筛，250±9.9um），称取粉末25g，于恒温干燥箱60℃干燥至恒重。置于250mL锥形瓶中，加入95％乙醇50mL，置于水浴中加热回流4小时。过滤，将滤液浓缩至大约25mL，得到白花蛇舌草浸膏，置于冰箱备用[4-5]。2.聚酰胺树脂柱分离总黄酮加入适量蒸馏水，充分搅拌，于冰箱放置过夜。次日离心，收集上清液，加入到聚酰胺树脂柱中，调节流速5mL/min，用蒸馏水洗去杂质，以80％乙醇为流动相解吸附，回收乙醇，得到总黄酮提取物，浓缩至膏状[6]。3.总黄酮含量测定选择410nm为测定波长，以芦丁作标准液[4]，用标准曲线法测定含量。①标准曲线的绘制分别取芦丁标准液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL于10mL容量瓶，加入4mL三氯化铝溶液，然后用95％乙醇定溶，摇匀，静置15min。在410nm处测定吸光度值，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线图，得到线性回归方程。②总黄酮溶液吸光度的测定取三个10mL容量瓶，分别加入1mL上述产品，加入4mL三氯化铝溶液，用95％乙醇定容，摇匀，静置15min。在410nm处测定吸光度，取三组平均值，代入线性回归方程，得到黄酮类化合物浓度。计算含量，产率。参考文献[1]江苏省药品监督管理局.江苏省中药饮片炮制规范[S].江苏:江苏科学技术出版社.2002:238.[2]于新,杜志坚,陈悦娇等.白花蛇舌草提取物抗氧化作用的研究[J].食品与发酵工业.2002,28(3):10-2.[3]王宇翎,张艳,方明.等.白花蛇舌草总黄酮的抗炎及抗菌作用[J].中国药理学通报.2005,21(3):348-350.[4]杨悠,许军,刘燕华,熊俭.比色法测定白花蛇舌草中总黄酮含量的研究[J].中华中医药学刊,2011(2):313-316.[5]吴杨,周忆新,吴银生.白花蛇舌草总黄酮的提取以及体外对肝癌细胞的作用[J].抗感染药学,2008,5(3):150-152.[6]毛杏飞,罗佳波.白花蛇舌草中总黄酮提取分离工艺的研究[J].中药材.2002,7:499-502.