白藜芦醇对MCF-7细胞的促凋亡作用研究605

2014届本科生毕业论文白藜芦醇对MCF-7细胞的促凋亡作用研究1白藜芦醇对MCF-7细胞的促凋亡作用研究解东洋（生物与化学工程学院12级12生物技术）指导教师：薛宏宇摘要目的：探讨白藜芦醇（RES）对人乳腺癌MCF-7细胞活性的作用和细胞凋亡的影响。方法：通过对人乳腺癌MCF-7细胞的培养，对药物白藜芦醇溶液进行不同浓度梯度的设置，进而对细胞进行诱导，用Hoechst33258染料对被药物诱导后的细胞染色，经细胞固定液固定后，置于荧光倒置显微镜下，观察其细胞核碎裂形态；应用四唑蓝比色法（MTT）对细胞进行活性检测；用DNALadder实验观察DNA断裂的条带。结果：在白藜芦醇的干预下，细胞核染色质出现高度固缩且部分裂解成碎块。MTT检测表明白藜芦醇能明显降低人乳腺癌MCF-7细胞的活性。DNA电泳后出现寡核苷酸片段增多。结论：人乳腺癌MCF-7细胞在体外培养条件下，白藜芦醇对其细胞的活性和凋亡有显著地影响。关键词白藜芦醇；MCF-7细胞；细胞凋亡；MTT；Hoechst33258ABSTRACT：Toinvestigatetheeffectofresveratrol(RES)ontheproliferationofhumanbreastcancerMCF-7cellinhibitionandapoptosis.Method:throughthecultivationofhumanbreastcancerMCF-7cells,differentconcentrationgradientondrugresveratrolsolution,andthenthecellswereinducedbyHoechst33258,dyeondruginducedcellstaining,thecellswerefixed,underfluorescentmicroscope,toobserveitsnuclearfragmentationpatterns;applicationfourtetrazoliumcolorimetricmethod(MTT)foractivitydetectionincells;bandsobservedbyDNALadderDNAfracture.Results:Resveratrolintervention,nuclearchromatinpyknosisandhighdecompositionintopieces.MTTdetectionshowthatresveratrolcaninhibitthegrowthofhumanbreastcancerMCF-7cellactivity.DNAelectrophoresisafteroligonucleotidefragmentsincreased.Conclusion:MCF-7humanbreastcancercellsinvitro,resveratrolhadsignificantinhibitoryeffectoncellproliferation.Keywords：Resveratrol;MCF-7cell;Apoptosis;MTT;Hoechst33258前言白藜芦醇（RES）是一种多酚类化合物，具有顺式及反式两种结构，且都具有生物学活性，其化学名为芪三酚(3,4',5-三羟基-二苯乙)，2014届本科生毕业论文白藜芦醇对MCF-7细胞的促凋亡作用研究2图1白藜芦醇化学结构图主要富含于多种天然植物如葡萄、虎杖等中，且在新鲜的葡萄皮内含量较为丰富。白藜芦醇有广泛的生物学功能，在生物有机体中具有抗癌、抗炎症、保护心血管系统、清除自由基和抑制血小板凝集等作用。在1993年Jayafilake等的研究结果表明反式和顺式的白藜芦醇都具有抗癌活性，指出其抗癌的分子生物学机制是它们可以通过抑制蛋白质-酪氨酸激酶的活性而促使细胞凋亡。随后Jang等的研究课题小组进一步得出结论，白藜芦醇在起始、增进和发展的3个癌症发生阶段过程中，都具有较为强烈的预防细胞癌变能力，并且对癌症发生的3个阶段都有抑制乃至逆转作用。抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞分化，诱导癌细胞凋亡[1-2]。在1997年1月，美国芝加哥IllinoisUniversity药学院的教授JohnPezzuto带领的研究小组在著名的美国《Science》杂志上，发表了其多年的研究成果《葡萄的天然产物白藜芦醇的抗癌活性》，这一论文的结果对医学科学界造成了重大的轰动。论文通过大量实验证明了白藜芦醇可以有效地抑制细胞癌变相关过程的细胞活动[3-5]。白藜芦醇还可以作为抗氧化剂、抗突变剂和抗炎剂，实验证明在对癌症的化学预防能力方面，它不仅能够防止正常细胞癌变并能有效阻止恶性肿瘤的无规扩散，还能够对蛋白酪氨酸激酶给予抑制，借此以阻止激酶功能从而产生抗突变作用[6]。通过以上材料可以看出，白藜芦醇具有可以抑制多种癌细胞增殖的作用，并且可以促进癌细胞的凋亡，具有明显地预防肿瘤的作用。但是通过查找近年来的各类相关研究资料[7-10]，发现有关白藜芦醇对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及其凋亡作用的研究仍相对较少，寥寥无几。因此，本实验通过设置不同的白藜芦醇浓度对MCF-7细胞进行体外诱导，从而探讨其生长抑制与剂量、时间和凋亡与剂量的作用关系。2014届本科生毕业论文白藜芦醇对MCF-7细胞的促凋亡作用研究31材料和方法1.1材料人乳腺癌细胞株（MCF-7细胞株）由宿州学院化学与生命科学院动物细胞实验室冻存；白藜芦醇（用PBS和乙醇溶解，配置成1mM/L的储备液）；新生小胎牛血清：天津药研所；Dulbecco`smodifiedEagle`smedium（DMEM）：美国GIBCO公司；胰蛋白酶（Ameresco）：北京拜尔迪生物公司；MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylterazoliumbromide）：美国Sigma公司；Hoechst33258：美国Sigma公司；青霉素、链霉素：大连制药厂；DNAmarker、DNALadder检测试剂盒：上海Beyotime公司；其他试剂均为分析纯。Milliporesimplicity-185超纯水器：美国密理博公司；酶标仪购置于美国Thermo公司；倒置荧光显微镜IX71购置于日本OLYMPUS公司。1.2方法1.2.1细胞培养液的配置1.2.1.1平衡盐溶液（PBS）的配制称取NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO43.63g、KH2PO40.24g，将上述溶质加入800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4(范围控制在7.2-7.4)，最后加蒸馏水定容至1L即可，在高压下蒸汽灭菌30min，于4℃保存于冰箱中。1.2.1.2胰蛋白酶溶液的配制称取胰蛋白酶粉末0.25g置烧杯中，溶解于100mlPBS中，配成0.25%的溶液。用孔径为0.22μm的无菌滤膜对配制好的胰蛋白酶溶液进行过滤除菌后，予以分装，保存在-20℃的环境中。1.2.1.3培养基的配置称取13.5g的干粉培养基，加入800ml的三蒸水中，磁力搅拌使之完全溶解。添加1.5gNaHCO3加水定容到终体积。用1mol/LHCl以及1mol/LNaOH调节培养基的PH值。用无菌0.22μm滤膜过滤除菌，加入100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、10%血清，然后分装于瓶中，无菌封口后藏于4℃冰箱中保存。1.2.1.4白藜芦醇浓缩液的配置取白藜芦醇粉末22.825mg，用10mlPBS溶液溶解，使其最终母液浓度为2014届本科生毕业论文白藜芦醇对MCF-7细胞的促凋亡作用研究41.0mM/L。然后在超净工作台内经0.22μm滤膜过滤除菌，分装于1.5ml的EP管内，每管1.0ml，标记上配制日期，藏于4℃冰箱内备用。1.2.1.5人乳腺癌MCF-7细胞的培养[11]从-80℃冰箱内取出已冻存的人乳腺癌MCF-7细胞，对其进行复苏，加入已配制好的DMEM培养基，放入37℃、5%CO2的细胞培养箱里进行细胞培养。当瓶内细胞生长形态良好、数量约90%时，对其进行传代培养。传代培养操作步骤如下：（1）在超净工作台内，用移液枪吸掉或缓慢倒出瓶内旧培养液于废液缸中。（2）向瓶内加入少量0.25%的胰蛋白酶（1ml左右），以能覆盖培养瓶底为宜。（3）放置在37℃的细胞培养箱内或室温（25℃温度）环境下进行细胞消化，一般2—3min后即可取出培养瓶，在倒置显微镜下对其进行观察，当发现瓶底面上的细胞出现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即对细胞消化给予终止。（4）用移液枪移除消化液，向瓶内与覆盖有细胞那一面相对的一面，用移液枪加入PBS溶液少量，轻轻转动培养瓶，用于冲洗掉培养瓶内的残留消化液，反复两次，然后再加入适量培养液。（5）使用吸管吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作切忌用力过猛，要轻柔，以防对细胞造成损伤。（6）对吹打均匀的细胞悬浮液，用细胞计数板对其进行计数，且稀释到所规定的细胞量以后，再分别接种于新的无菌培养瓶内，置放于CO2培养箱中培养。实验时取对数生长期细胞。1.2.2Hoechst33258染色（1）4%多聚甲醛固定液的配制：用电子天平称取粉末状多聚甲醛40g，NaH2PO42.965g，Na2HPO429g，将其倒入洁净的三角烧瓶内，然后加入1000ml蒸馏水，在设置为60℃的磁力搅拌器上加热振荡24h。最后调节其PH为7.2，即可使用。切忌在固定细胞时，应现配现用。（2）Hoechst33258的配制：用精密微量电子天平称取Hoechst33258（粉末状）1mg置于洁净无菌的三角烧瓶内，加入PBS溶液200ml，振荡使之彻底溶解，分装后避光保存。（3）Hoechst33258染色操作步骤：首先对细胞进行计数，设置细胞量为105个2014届本科生毕业论文白藜芦醇对MCF-7细胞的促凋亡作用研究5/ml，将贴壁细胞以105个/ml接种于12孔板或6孔板，细胞分别用10、20、40、60、80umol/L的白藜芦醇干预12、24或48h后，空白对照组添加等量的试剂PBS和乙醇混合溶剂（1:1）作为参照品。完成以上步骤后，用PBS缓冲液润洗2次，用多聚甲醛溶液固定15min,洗涤后用Hoechst33258避光染色30min,用PBS洗涤一次后即可。在倒置荧光显微镜下观察并拍照。1.2.3倒置荧光显微镜观察细胞形态变化乳腺癌细胞MCF-7经白藜芦醇诱导后，通过固定液多聚甲醛（4%）的固定以及荧光染液Hoechst33258（5mg/L)的染色，即可于倒置荧光显微镜下紫外光激发染料呈蓝色，200倍镜下观察拍照。记录好拍摄时间及本次实验的相关数据。1.2.4MTT活性检测实验开始前，首先选取经培养24h以后的生长状况良好的MCF-7细胞，取对数生长期进行计数，使细胞量达到105个/ml，将细胞重新接种于96孔板中培养。实验设置5个不同给药浓度梯度，分别以10、20、40、60、80umol/L的白藜芦醇溶液为处理组及浓度为0umol/L的白藜芦醇等量的PBS为对照组，每种所给药浓度设置了3个重复孔，并以空白孔数据调零。细胞经过24h的培养后，每组培养液将被换成所含白藜芦醇的不同浓度培养液，再对其进行12、24、48h的继续培养，随后每孔加入10ul浓度为5g/L的MTT溶液，继续于培养箱内培养2h后弃去上清液，每孔加入150ul的DMSO溶解样品，用酶标仪测定各孔490nm波长的OD值。通过细胞抑制率公式所获得的数据采用Student’s-t软件计算均数及标准差，并进行方差分析，组间差异采用t检验。1.2.5DNALadder实验1.2.5.11.2％琼脂糖凝胶的配制（1）称量。称取琼脂糖0.3g，TBE缓冲液25ml，置于三角锥形瓶内，轻轻振动一下，使其在瓶内均匀。（2）熔胶。将锥形瓶中混合后的琼脂糖和TBE缓冲液在微波炉内反复加热2～3次，直至琼脂糖溶解且并无气泡。（3）进行倒胶。待琼脂糖溶液不烫