第四章色谱分离技术

《生物分离与纯化技术》授课教案第四章色谱分离技术教学目的：了解色谱分离技术的特点和应用；熟悉吸附色谱分离技术的概念、分类、特点及其应用；熟悉离子交换色谱技术的概念、特点及其应用；掌握凝胶色谱分离技术的操作及应用；掌握亲和色谱分离技术常用载体和配基及其制备方法，掌握亲和色谱分离技术的操作；掌握高效液相色谱分离技术常用的固定相、流动相及其选择方法，掌握高效液相色谱分离技术的操作。教学重点：离子交换色谱技术的概念、特点及其应用，凝胶色谱分离技术的操作及应用，亲和色谱分离技术常用载体和配基及其制备方法，高效液相色谱分离技术的操作。教学难点：亲和色谱分离技术的操作；高效液相色谱分离技术常用的固定相、流动相及其选择方法。教学课时：16学时教学方法：多媒体教学教学内容：第一节概述一、色谱分离技术的概念色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。二、色谱分离系统的组成三、色谱分离技术的分类但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱等四、色谱分离技术的特点1.分离效率高，每米柱长可达几千至几十万的塔板数；2.应用范围广，从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、无机到有机及生物3.活性物质，以及热稳定到热不稳定的化合物，尤其是对生物大分子样品的分离，是其他方法无法代替的；4.选择性强；5.高灵敏度的在线检测，可采用不同的高灵敏度检测器进行连续的在线检测；6.快速分离；7.过程自动化操作。第二节吸附色谱分离技术1、原理：利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离2、关键要素：吸附剂（固定相）和展开剂（流动相）的选择3、吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH24、常用的吸附剂：氧化铝、硅胶、活性炭、纤维素、聚酰胺、硅藻土5、展开剂的选择展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果展开剂选择的原则：（1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小（2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力6、吸附色谱的操作程序（1）根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相（2）吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数（3）洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物第三节离子交换色谱分离技术1、概念：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法2、常用的离子交换树脂（1）葡聚糖凝胶型DEAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-25，CM-SephadexC-25，SP-SephadexC-25（2）纤维素系列离子交换剂DEAE-SephacelCellex系列（3）琼脂糖系列离子交换剂Sepharose系列SepharoseCL-6B,SepharoseFastFlowBio-GelA系列交联琼脂糖离子交换剂（4）Source系列离子交换剂特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低阳离子交换树脂S系列阴离子交换树脂Q系列（5）MonoBeads系列离子交换剂（Pharmacia）特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。同样分为Q系列和P系列第四节凝胶色谱分离技术1.概念：凝胶色谱以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，又称为分子筛色谱（MolecularSieveChromatography，MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（SizeExclusionChromatography，SEC）。2.凝胶：是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。当混合物随流动相流经凝胶柱时，较大的分子不能进入所有的凝胶网孔而受到排阻，它们将与流动相一起首先流出，较小的分子能进入部分凝胶网孔，流出的速度较慢，更小的分子能进入全部凝胶网孔，而最后从凝胶柱中流出。3.应用：凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。4.应用举例：（1）去热原将离子交换树脂制备的无盐水通过羟型DEAE-A-25凝胶，可制得无热原水，用于注射。（2）纯化青霉素用葡聚糖凝胶G-25（粒度为20～80μm）分离青霉素中的一些高分子杂质（青霉素聚合物、青霉噻唑蛋白），去除这些强烈致敏性的全抗原。（3）大分子物质的分子量测定第五节亲和色谱分离技术所谓亲和色谱就是将亲和技术和色谱技术集成得到的一种高效分离手段，其原理与亲和吸附基本类似，所不同的是经过修饰的载体颗粒是填充在色谱柱中，以实现连续的色谱分离载体活化、配基连接、吸附、洗脱ACver99032630Stericconsiderations&spacerarmsSmallligand(1,000)RiskofstericinterferencewithbindingbetweenmatrixandtargetmoleculeOftenneedspacerarmbutwatchoutforadsorptiontothespacer!Spacerarm第六节高效液相色谱分离技术1、高效液相色谱仪的分析原理2、HPLC色谱柱及其填料的特征HPLC色谱柱的基质材料a)硅胶与聚合物b)现代高效液相色谱填料的特征色谱柱结构固定相c)键合相d)色谱柱接头e)键合相稳定性3、HPLC色谱柱的构成类型内径D(cm)柱长(cm)粒径(µm)分析柱0.3–0.463-253-10微孔柱0.1,0.2115,253-8半制备柱0.8–1.010-255-20制备柱2.0–5.010-255-204、评价色谱柱好坏的标准1）理论塔板数N2）拖尾因子Tf3）色谱柱背压4)色谱柱批与批之间的重现性5）pH值的适用范围高压泵进样器检测器色谱工作站色谱柱6）使用寿命5、现代高效液相色谱柱的要求•超纯B型球形硅胶——峰形好、柱效高。•不能有使色谱性能降低的直径小于50Å的微孔。•粒径尺寸从3µm到10µm——能满足从分析到制备色谱规模的需求。•色谱柱柱床装填好——使用寿命长、柱效高。•封尾彻底——峰形好、使用寿命长。•批与批之间得重现性好。•不同的相具有不同的选择性——能更好的实现分离。•键合相化学稳定好——适用的pH范围广,使用寿命长。