第四章药物定量分析

1第四章药物定量分析第一节定量分析样品的前处理方法常用的处理方法：药物分析中常用的分析方法1.不经有机破坏的分析方法2.经有机破坏的分析方法一．不经有机破坏的分析方法（1）直接测定法。如富马酸亚铁(用于各种原因引起的缺铁性贫血)溶于热稀矿酸，采用铈量法，邻二氮菲作指示剂富马酸亚铁的含量测定:取本品约0.3g，精密称定，加稀硫酸15ml，加热溶解后，放冷，加新沸过的冷水50ml与邻二氮菲指示液2滴，立即用硫酸铈滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫酸铈滴定液(0.1mol/L)相当于16.99mg。（2）经水解后测定法1.直接回流后测定法.例如：三氯叔丁醇的含量测定CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH=(CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2ONaCl+AgNO3=AgCl+NaNO3AgNO3+NH4SCN=AgSCN+NH4NO32.用硫酸水解后测定法.例如：硬脂酸镁的含量测定Mg(C17H35COO)2+H2SO4=MgSO4+2C17H35COOHH2SO4+2NaOH=Na2SO4+2H2O取本品约0.1g，精密称定，精密加硫酸滴定液(0.05mol/L)50ml，煮沸至油滴澄清,继续加热10min，放冷至室温，加甲基橙指示液1-2滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相当于2.016mg的MgO。（3）经氧化还原后测定法1.碱性还原后测定例如：泛影酸（用于泌尿系造影）的含量测定(曙红钠指示剂)2.酸性还原后测定(硫酸铁铵指示剂)例如：碘番酸（口服胆囊造影剂）的含量测定Zn还原后银量法3.利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量（1）含锑药物例如：葡萄糖酸锑的含量测定Sb5++2KI=Sb3++2K++I2I2+2Na2S2O3=2NaI+Na2S4O6（连四硫酸钠）2）含铁药物2Fe3++2KI=2Fe2++2K++I2I2+2Na2S2O3=2NaI+Na2S4O6二、经有机破坏的分析方法药物分析中常用的有机破坏的方法有干法破坏湿法破坏氧瓶燃烧法(一)湿法破坏HNO3-HClO4法；HNO3-H2SO4法；H2SO4-硫酸盐法；HNO3-H2SO4-HClO4法；H2SO4-H2O2；H2SO4-KMnO4(二)干法破坏（加Na2CO3或MgO以助灰化；温度控制在420℃）本法系将有机物灼烧灰化以达分解的目的。将适量样品置于瓷、镍、铂坩埚中，常加无水碳酸钠或轻质氧化镁等以助灰化，混合均匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全，即可.(适用于湿法不易破坏完全的有机物（如含氮杂环类有机药物）以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物)(三)氧燃瓶燃烧法(oxygenflaskcombustionmethod)原理：将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或测定含卤素有机药物或含硫、氮、硒等其它元素的有机药物。1.仪器装置500ml,1000ml,2000ml,磨口、硬质玻璃锥形瓶;2.称样：固体样,液体样;3.燃烧分解操作法;4.吸收液的选择用于X、S、Se等的鉴别、检查、含量测定时多数是H2O或H2O-NaOH；少数为H2O-NaOH-H2O2应用示例：碘苯酯（脊髓蜘蛛膜下腔造影剂，诊断药）的COOHIIINHCOCH3CH3CONHCOOHH2NNH2+11NaOH+3Zn+3NaI+2CH3COONa+3NaZnO2+3H2ONaI+AgNO3AgI+NaNO3ICHCH3(CH2)8-COOC2H5I2O2(I)_I2+2NaOHNaIO+NaI+H2O3NaIONaIO3+2NaI3Br2+I+3H2OIO3+6HBrBr2(guo)+HCOOHHBr+CO2IO3+5I+6H3I2+3H2OI2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6CH3COOH-+---2测定第二节定量分析方法特点一、容量分析法容量分析法的特点：操作简单、快速；比较准确（RSD＜0.2%）；仪器普通易得。（二）、容量分析法的计算问题1.滴定度(T）：每毫升滴定溶液相当于被测物质的量(mg/mL)。2.滴定度的计算aA+bB=cC+dDT=MA×b/a×VB（B指标液，A指被测物）3.百分含量的计算：（1）直接滴定法D%=V×F×T/W×100%F=实际标定的浓度/规定的浓度（滴定液浓度校正因子）（2）间接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）D%=（VO–VB)×F×T/W×100%二、光谱分析法（一）紫外-可见分光光度法（200nm～760nm)1.特点：灵敏度高，可达10-4g/ml～10-7g/ml准确度高，RSD（%）为2%～5%仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用范围广。2.朗伯-比耳定律A=ECL,E1%1cm=ε×10/M5.测定方法要求供试品溶液的A应在0.3～0.7常用方法：对照品比较法：Cx=(Ax/Ar)Cr;含量%=Cx×D/W×100%；吸收系数法：含量%=(E1%1cm)x/(E1%1cm)r×100%；计算分光光度法：VA的三点校正法[（1）供试品中干扰物质（有关物质及稀释用油）的吸收在310~340nm的波长范围内呈线性，且吸收度随波长的增大而下降。即在维生素A最大吸收波长附近，干扰物质的吸收几乎呈一直线。（2）物质对光的吸收具有加和性，即在供试品溶液的吸收曲线上，各波长处的吸收度是维生素A的吸收与无关吸收的加和值，吸收曲线也是两者吸收曲线的叠加。]（二）荧光分光光度法(在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC)1.特点：灵敏度高，可达10-10g/ml～10-12g/ml；在低浓度进行测定,防止F与C不成正比及自熄灭作用;用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减;灵敏度高，但干扰因素多;制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选择性用样品量少，操作简单，方法快速，应用范围较广2.荧光分析仪有二个单色光器—激发单色光器与发射单色光器；且激发光源、样品池和检测器成直角3.含量测定常用的方法对照品比较法:Ci=(Ri-Rib)/(Rr-Rrb)×Crch.P收载地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片三、色谱分析法方法分类按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱按分离方法分为：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC。（一）HPLC法1.对HPLC仪器一般要求色谱柱、流动相按品种项下要求。2.系统性试验色谱柱的理论板数：n=5.54(tR/Wh/2)2.分离度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5;拖尾因子：T=W0.05h/2d1应在0.9～1.053.测定方法:内标法加校正因子测定供试品中主成分含量,外标法测定供试品中主成分含量(标准曲线法，外标一点法)应用示例：RP-HPLC法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法，如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法..（二）GC法1.对GC仪器一般要求载气为氮气；色谱柱为填充或毛细管柱2.系统性试验同上述HPLC法，测定方法亦同应用示例：Ch.P(2000)收载的月桂卓酮、维生素E及其片剂、注射剂、甲酚皂溶液等均采用GC法中的内标法加校正因子测定含量。四、方法的选择和应用药品常用含量的测定方法有容量分析法、光谱法和色谱法，各法具有不同的准确度、专属性和灵敏度，应根据样品中被测组分含量高低及共存组分干扰程度等因素选择合适的分析方法。原则：主药量大，附加成份不干扰-容量法或重量法测定;主药可溶于有机溶剂提取后测定-光谱法;主药量少-光谱法或色谱法.1、化学原料药纯度较高，限度严格，如果杂质可严格控制，选择方法时可侧重准确性。2、中药材及其成方制剂成分复杂，被测组分一般含量较低，共存组分干扰严重，选择方法时应侧重于方法的专属性和灵敏度。3、化学药物制剂种类较多，选择分析方法时应根据制剂中被测组分的含量高低、复方制剂中共存组分影响以及辅料成分的干扰程度进行选择。（见教材)4、应用实例。（见教材)第三节药品质量标准分析方法验证3一、准确度指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率(比值）表示(指在实际样品中加入已知量的标准物质和样品于相同条件下进行测量,用所得结果计算.)（一）含量测定方法的准确度1.原料药：可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确度的另一方法测定的结果进行比较。2.制剂要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3,共9个数据来评价回收率的RSD＜2%；用UV和HPLC发时，一般回收率可达98%～102%；容量法可达99.7%～100.3%回收率%=（测定平均值—空白值）/加入量×100%二、精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果之间的接近程度。（一）精密度表示方法1.偏差(deviation,d)d=测得值-平均值=Xi-X2.标准偏差（standarddeviation,SD或S）S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/23.相对标准差(relativestandarddeviation,RSD)也称变异系数(coefficientofvariation,CV)RSD=标准偏差/平均值×100%=S/X×100%（二）重复性、中间精密度及重现性1.重复性在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度.2.中间精密度在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度。3.重现性在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。三、专属性是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。（一）鉴别反应应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应。四、检测限（limitofdetection,LOD)是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。（一）常用的方法1.非仪器分析目视法用已知浓度被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。2.仪器分析方法UV法：LOD=f.3S空=C样/A样×3S空Flu法：LOD=f.3S空=C样/(F样-F空)×3S空GC和HPLC法：LOD=S/N=2或3（二）数据要求应附测试图，说明测试过程和检测限结果。五、定量限（limitofquantitation,LOQ)是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求LOQ.常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10时相应的浓度进行测定。六、线性是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。UV法：首先制备一个标准系列，浓度点n=5;A=0.3～.0.7建立回归方程C=aA+b;r＞0.9999。HPLC法：制备一个标准系列，浓度点n=5～7;以C对h或A或与内标物的峰面积之比，建立回归方程r＞0.9999。七、范围是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的80%-～120%。制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的70%-～130%。溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的±20%。八、耐用性是指在测定条件下有效的变动时，测定结果不受影响的承受程度。典型的变动因素有：被溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。HPLC法变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。GC法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。分析方法效能指标的具体应用：1.用于鉴别试验的方法：只要求专属性、耐用性，其余不要求。2.用于原料药中杂质测定和制剂中降解产物测定的方法：①用于定量：除了检测限不要求外，其余七项指标均要求。②