第四章血液分析仪及其临床应用

第1页第四章血液分析仪及其临床应用第一节概述20世纪50年代初，电子血细胞计数仪开始应用于临床，随着电子技术、流式细胞术、激光技术、单克隆抗体、计算机等高科技在血细胞分析仪上的应用，血液分析仪的研制水平不断提高，检测原理不断完善，测量参数不断增多，现代血液分析仪（HA）具有下列特点：1.自动化程度越来越高。2.通过条形码识别、自动运输装置、自动混匀、自动进样、自动检测、自动报告、自动清洗、自动涂片，形成了模块式自动化血液分析流水线。3.提供参数越来越多：能提供18～40多个参数，如有核红细胞数、淋巴细胞亚群数等。4.精度越来越高：采用定容计量、定时监控、三次平均法计数、延时计数等使精密度大大提高。5.速度越来越快：每小时可分析50～150份样本。6.强大的质控功能：有自动记录质控结果、可供选择的质控规则、自动绘制质控图、失控报警、患者结果浮动均值和患者结果Delta核查和报警等功能。7.智能化程度越来越高：提供简明直观的直方图或散点图、提示异常结果报警信号、备有专家诊断系统和远程会诊等功能。第二节检测原理本节要点：（1）电阻抗法血液分析仪检测原理（2）光散射法血液分析仪检测原理（一）电阻抗法血液分析仪检测原理1.电阻抗法血细胞计数原理（库尔特原理）将等渗电解质溶液稀释的细胞悬液置入不导电的容器中，将小孔管（也称传感器）插进细胞悬液中。小孔管内充满电解质溶液，并有一个内电极，小孔管的外侧细胞悬液中有一个外电极。当接通电源后，位于小孔管两侧电极产生稳定电流，稀释细胞悬液从小孔管外侧通过小孔管壁上宝石小孔（直径l00μm，厚度约75μm）向小孔管内部流动，使小孔感应区内电阻增高，引起瞬间电压变化形成脉冲信号，脉冲振幅越高，细胞体积越大，脉冲数量越多，细胞数量越多，由此得出血液中血细胞数量和体积值。电阻抗原理示意图2.白细胞分类计数原理根据电阻抗法原理，经溶血剂处理的、脱水的、不同体积的白细胞通过小孔时，脉冲大小不同，将体积为35～450fl白细胞，分为256个通道，其中，淋巴细胞为单个核细胞、颗粒少、细胞小，位于35～90fl的小细胞区，粒细胞（中性粒细胞）的核分多叶、颗粒多、胞体大，位于160fl以上的大细胞区，单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、原始细胞、幼稚细胞等，位于90～160fl的单个核细胞区，又称为中间型细胞。仪器根据各亚群占总体的比例，计算出各亚群细胞的百分率，并同时计算各亚群细胞的绝对值，显示白细胞体积分布直方图。第2页三分类血球分析仪工作原理示意图3.血红蛋白测定原理当稀释血液中加入溶血剂后，红细胞溶解并释放出血红蛋白，血红蛋白与溶血剂中的某些成分结合形成一种血红蛋白衍生物，在特定波长（530～550nm）下比色，吸光度变化与稀释液中Hb含量成正比，最终显示Hb浓度。不同类型血液分析仪，溶血剂配方不同，所形成血红蛋白衍生物不同，吸收光谱不同，如含氰化钾的溶血剂，与血红蛋白作用后形成氰化血红蛋白，其最大吸收峰接近540nm。（二）光散射法血液分析仪检测原理1.光散射法白细胞计数和分类计数原理（1）激光与细胞化学法1）过氧化物酶检测通道白细胞经过氧化物酶染色后，胞质内显示细胞化学反应。过氧化物酶活性：嗜酸性粒细胞中性粒细胞单核细胞，淋巴细胞和嗜碱性粒细胞无过氧化物酶活性，此为血液分析仪白细胞分类的基础。当激光束照射到细胞时，产生不同强度的散射光，以吸光率（酶反应强度）为X轴，光散射（细胞大小）为Y轴，每个细胞根据这两个信号的不同，定位在散点图上。各类白细胞在散点图上的位置2）嗜碱性粒细胞／分叶核检测通道血液与酸性表面活性剂反应，不仅红细胞溶解，而且除嗜碱性粒细胞外，其他所有白细胞膜均被破坏.胞质溢出，仅剩裸核。当激光束照射到细胞时，产生不同强度的散射光，形成二维细胞图，其中，嗜碱性粒细胞呈高狭角散射，定位于细胞图上部，裸核细胞则位于细胞图下部。嗜碱性粒细胞和分叶核粒细胞在散点图上位置（2）容量、电导、光散射（VCS）法1）利用电阻抗法原理测量细胞体积（V）。2）利用电导（C）技术测量细胞内部结构。原理是利用高频电磁探针测量细胞内部结构，根据细胞核和细胞质比例、细胞内颗粒大小和密度来识别体积相同、但性质不同的两类细胞群体，如小淋巴细胞和嗜碱性粒细胞。3）利用光散射（S）技术测量细胞形态和核结构。原理是利用激光照射进入计数区的每个细胞，根据散射光角度（10°～70°）的不同，提供每个细胞形态、核结构信息来鉴别中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。五分类血球分析仪原理示意图V（volume）体积测量采用电阻抗原理；C（conductivity）电导性是根据细胞壁能产生高频电流的性能，采用高频电磁探针测量细胞内部结构；S（scatter）光散射是来自激光的单色光束对细胞进行扫描，提供细胞结构和形态的变化。根据VCS原理，显示3种细胞散点图：DF1（体积和散射光）、DF2（体积和电导）、DF3（体积和电导，但只显示嗜碱性粒细胞群）。DF1图通过体积和散射光显示不同白细胞位置DF2图通过体积和电导显示单核细胞、粒细胞和淋巴细胞位置第3页DF3通过体积和电导显示嗜碱性粒细胞群、单核细胞和淋巴细胞位置（3）电阻抗与射频法1）嗜酸性粒细胞检测系统：血液与嗜酸性粒细胞特异性溶血剂混合，使除嗜酸性粒细胞外的所有细胞溶解或萎缩，采用电阻抗法计数嗜酸性粒细胞。2）嗜碱性粒细胞检测系统:血液与嗜碱性粒细胞特异性溶血剂混合，使除嗜碱性粒细胞外的所有细胞溶解或萎缩，采用电阻抗法计数嗜碱性粒细胞。3）白细胞分类检测系统：采用电阻抗和射频（能透入细胞内，测量核大小、颗粒多少）法，以直流电（DC）为横坐标，以射频（RF）为纵坐标，根据这两个信号将细胞定位于二维细胞散射图上，因淋巴细胞、单核细胞、粒细胞的大小、胞质量、胞质内颗粒大小和密度、细胞核形态和密度各不相同，从而进行分类。4）幼稚细胞检测系统：根据幼稚细胞膜上脂质较成熟细胞少的特性进行检测。在细胞悬液中加入硫化氨基酸，幼稚细胞的结合量多于较成熟的细胞，而且，幼稚细胞对溶血剂有抵抗作用，当加入溶血剂后，成熟细胞被溶解，幼稚细胞不被破坏，从而提供幼稚细胞信息（IMI）。显示幼稚细胞的位置（4）多角度偏振光散射（MAPSS）法当激光束照射到单个细胞时，从4个角度测定散射光密度：①0°：前角光散射（1°～3°），可测定细胞大小；②10°：狭角光散射（7°～11°），可测定细胞内部结构特征；③90°：垂直光散射（70°～110°），可测定细胞核分叶情况；④-90°：消偏振光散射（70°～110°），可将嗜酸性粒细胞和其他细胞区分出来。多角度偏振光散射（MAPSS）法检测原理2.光散射法红细胞检测原理以低角度前向光散射和高角度光散射同时测量1个红细胞。低角度（2°～3°）光散射能测量单个红细胞体积，高角度（5°～15°）光散射能测量单个红细胞血红蛋白浓度，得出MCV、MCH、MCHC值，并显示红细胞散射图、单个红细胞体积和血红蛋白含量直方图。3.光散射法血小板检测原理单个球形化血小板通过激光束照射后，高角度（5°～15°）光散射能测量细胞折射指数（RI），低角度（2°～3°）光散射能测量细胞大小。在二维散射图上得出血小板数量和相关参数。4.网织红细胞计数原理（1）利用新亚甲蓝使网织红细胞RNA着色，加入使红细胞内Hb溢出的试剂，使其成为“影细胞”，然后采用VCS原理，得出网织红细胞数和相关参数。（2）利用碱性槐黄O等荧光染料与网织红细胞内的RNA结合，以波长488nm氩氖激光束为激光源照射网织红细胞，得到前向散射光强度（细胞体积大小）和荧光强度（胞质内RNA多少），形成二维显示散点图，得出网织红细胞数和相关参数。显示网织红细胞（不同荧光强度）（左）显示红细胞、网织红细胞和血小板（右）第三节检测参数本节要点：（1）检测参数（2）检测结果及表达形式（一）检测参数第4页常见血液分析仪检测报告的术语和英文缩写词见表l-4-2。表1-4-2常见血液分析仪检测报告技术语和英文缩写词（二）检测结果及表达形式常用三分群血液分析仪参考值见表1-4-3。第四节血细胞直方图本节考点：（1）白细胞直方图（2）红细胞直方图（3）血小板直方图左图是细胞形成的不同大小的脉冲波，右图是根据脉冲波整理出的细胞直方图（一）白细胞直方图血液分析仪在计数细胞数量的同时，还提供细胞体积分布图形，横坐标为细胞体积大小，纵坐标为不同体积细胞的相对频率，称为细胞直方图。白细胞直方图代表意义正常白细胞直方图，在35～450fl范围内将白细胞分为3群，左侧峰又高又陡为淋巴细胞峰，最右侧峰又低又宽为中性粒细胞峰，左右两峰间的谷区较平坦为单个核细胞峰。异常直方图意义见表1-4-4。表15白细胞体积三分类急性淋巴细胞白血病时的白细胞直方图特点急性淋巴细胞白血病时的白细胞直方图特点急性非淋巴细胞白血病时的白细胞直方图特点慢性淋巴细胞白血病时的白细胞直方图特点所以，当发现某患者白细胞直方图改变为一个单一峰的曲线，务必要对血涂片进行检查，以排除急性白血病。千万不要漏诊。单核细胞增多或嗜酸细胞增多症时的白细胞直方图特点异常淋巴细胞增多症时的白细胞直方图特点第5页慢性粒细胞白血病时的白细胞直方图特点（二）红细胞直方图红细胞直方图曲线的峰顶对应的是红细胞的MCV，而曲线基底的宽度基本上反映红细胞的RDW。正常红细胞直方图，在36～360fl范围内分布两个细胞群体，从50～125fl区域有一个两侧对称、较狭窄的曲线，为正常大小的红细胞，从125～200fl区域有另一个低而宽的曲线，为大红细胞、网织红细胞。，当红细胞体积大小发生变化时，峰左移或右移，或出现双峰。（三）血小板直方图正常血小板直方图，在2～30fl范围内分布，呈左偏态分布，集中分布于2～15fl内。当有大血小板或小红细胞、聚集血小板时，直方图显示异常。血小板直方图受干扰的异常血小板直方图（a）大量红细胞碎片，（b）多数血小板聚集，（c）小红细胞增多。第五节方法学评价本节考点：（1）仪器性能的评价（2）干扰血液分析仪检测的因素（一）仪器性能评价1989年，ICSH公布了用于评价血液分析仪性能、优点和局限性的《含白细胞分类、网织红细胞计数和细胞标志检测的血液分析仪评价指南》。仪器性能评价内容见表1-4-5。1.样本要求血液样本要求在采集后4小时内进行处理，并需要各种类型的样本，以反映血液中各种成分质和量的变化（表1-4-6）。2.性能评价（1）稀释效应：包括①受倍比稀释影响的参数：用同源乏血小板血浆稀释压积细胞，得到各种浓度，如l00%，90%，80%……20%，10%，评价稀释度与参数之间的线性关系。理想情况下，线性范围越宽越好、回归线应通过原点。②不受稀释效应影响的参数：如红细胞平均指数，不受稀释度影响，理论上应为一条水平回归线。（2）精密度：包括批内、批间精密度和总精密度。①批内和批间精密度：是对同一批样本（批内或重复精密度）或二至多批样本（批间精密度）的重复测定，用CV值表示。理论上，精密度研究样本应覆盖整个病理范围，包括高、中、低值，进行重复测定，采用双因素方差分析进行批内、批间精密度评价。批间精密度受仪器校准和仪器漂移的影响。②总精密度：总重复性由批内、批间精密度和携带污染结果得出。实验时从一个较大范围中随机抽取样本，并在几小时内测定，采用单因素方差分析进行评价。若总精密度评价在较长时间内完成，样本贮存和稳定性也是重要影响因素。（3）携带污染：在运行临床样本前，必须对高值和低值样本的携带污染进行评价，保证交叉测量时仪器结果的稳定性。方法是连续测试高值样本3次（il、i2、i3），随后立即连续测试低值样本3次（jl、j2、第6页j3），按下列公式计算：（4）相关性：是仪器测定结果与常规方法相比的满意程度。采用大量的、未经选择的、覆盖所有预期范围的样本，用图形表达方式显示被评估仪器（Y轴）和常规方法（X轴）测定结果的差异，采用配对t检验进行统计分析。（5）准确度：是“估计值与真值之间的一致性”。真值由决定性方法或参考方法获得。血细胞计数的参考方法见表l-4-7。（6）样本老化：是采集静脉血