目的基因的亚克隆

目的基因的亚克隆所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。一、试剂准备1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用）5g，NaCl10g，加ddH2O至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌20min。2．1.5%琼脂LB固体培养基:称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100mlLB，15lbf/in2高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。3．IPTG、X-Gal4．0.1MMgCl2：15lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。5．0.1MCaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。6．限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶。二、目的DNA片段和载体的制备选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。在亚克隆时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。（实验操作同前述）三、利用T4DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接（一）连接要求和结果外源DNA片段末端性质连接要求连接结果不对称粘性末端两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。对称性粘性末端线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。平端要求高浓度的DNA和连接酶载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高。带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。（二）T4DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O至8μl。3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。4．加入含ATP的10×Buffer1μl，T4DNA连接酶合适单位，用ddH2O补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃水浴）连接8-14hr。四、连接产物的转化1.感受态细胞的制备⑴保存于-70℃的DH5α（或其他菌种）用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16hr）。⑵挑取单菌落，接种于2.0mlLB液体培养基中，37℃恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。⑶取0.5ml过夜培养液，接种于100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2hr。（注：以下操作均应在冰浴中进行。）⑷将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10min，弃去上清，用冰浴的0.1MMgCl225ml悬浮30min。⑸4℃离心,4000g×10min，弃去上清，加入冰浴的0.1MCaCl2-甘油溶液1ml悬浮。⑹以100μl/管分装入1.5ml离心管中，-70℃冻存备用。注：此法制备感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5×106-2×107个菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要，制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响，一般三个月以内转化效率无多大改变。2.连接产物的转化⑴取100μl贮存于-70℃钙化菌，冰浴化开；⑵加入适量连接产物（一般不超过10μl，轻轻混匀，冰浴20min；⑶于42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；⑷加入LB液体培养基200μl，于37℃缓摇孵育45min；⑸将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板（根据质粒性质添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12-16hr。五、重组子的筛选根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。六、注意事项1.目的DNA片段制备、回收、纯化时，应避免外来DNA污染。2.不同厂家生产的T4DNA连接酶反应条件稍有不同，但其产品说明书上均有最适反应条件，包括对不同末端性质DNA分子连接的T4DNA连接酶的用量、作用温度、时间等。同时提供有连接酶缓冲液（10×、5×、2×），其中多已含有要求浓度的ATP，应避免高温放置和反复冻融使其分解。2.连接产物的转化：细菌细胞经特殊试剂处理后在适当的条件下具有接收外源DNA的能力，因此可将上述连接产物通过热刺激或电脉冲转化感受态细胞，当细菌大量增殖的同时，导入的重组DNA也得到增殖。3.制备感受态细胞所用离心管、培养瓶最好经酸碱处理或使用新的，15lbf/in2高压灭菌20min。5.白色菌落中重组质粒内插入片段是否是目的片段需通过鉴定。