相互作用蛋白质组学唐冬雪.

相互作用蛋白质组学唐冬雪2016-06-072•蛋白质是生命过程的真正执行者，蛋白质相互作用与生命健康息息相关。因此，蛋白质互作研究也是基础生命科学的一个重点研究领域.•生物体的生理功能主要由细胞中的蛋白质控制和调节。其中，多数蛋白质是通过与配体结合或是作为蛋白质复合物中的一部分参与细胞的代谢过程。因此，研究蛋白质间的相互作用是理解生命活动的基础。3蛋白质相互作用研究方法一、酵母双杂交技术二、免疫共沉淀技术三、细胞共定位技术四、GSTPull-down技术五、FRET（荧光共振能量转移技术）六、BiFC（双分子荧光互补技术）七、TAP（串联亲和纯化技术）八、Far-Westernblot（亲和印迹技术）4一、酵母双杂交技术1.基本概述2.基本过程3.应用与优缺点5基本概述•酵母双杂交系统(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)是1989年由Fields等提出并初步建立的,主要用于研究真核生物的蛋白质。•该系统利用了酵母的转录激活因子GAL4，含有的两个结构域，DNA结合域(DNAbindingdomain,BD)及转录激活域(activationdomain,AD)，将已知基因（诱饵基因）和靶基因分别构建在含BD及AD质粒载体上，将两种质粒共同转化酵母感受态细胞，若BD结合的诱饵蛋白能够与AD结合的靶蛋白或文库中的某些cDNA编码的蛋白相互作用、彼此间结合时，则会导致位于侧翼的BD与AD在空间上接近，呈现GAL4转录因子的完全活性，激活下游的报告基因表达，从而在特定的选择性培养基上生长。6原理示意图78His3是编码组氨酸合成的基因，３-AT是它的竞争性抑制剂；ADE2是编码腺苷酸合成酶的基因。lacZ是编码β-半乳糖苷酶的基因，可以用β-半乳糖实验测定活性。MEL1编码α-半乳糖苷酶，可以降解X-α-Gal，产生蓝色。GAL1,GAL2和MEL1的上游激活序列(UAS)应答于GAL4转录激活因子。AH109衍生于PJ69-2A菌株，包括ADE2,HIS3营养标记和一个内源的MEL1基因，lacZ报告基因被引入PJ69-2A而得到AH109菌株。9基本过程构建表达载体pGBKT7-Bait醋酸锂转化法转化酵母AH109菌株感受态Bait菌株自激活验证含BD-Bait酵母与文库中酵母混合培养形成二倍体在三缺培养基筛选将阳性克隆划线至缺陷培养基检测对阳性克隆进行ColonyPCR后测序拿测序结果进行BLAST找出相应基因构建表达载体pGADT7-Prey（或直接提质粒）醋酸锂转化法转化酵母AH109菌株感受态Prey菌株自激活验证将BD-Bait与AD-Prey用醋酸锂转化法共转化酵母AH109菌株感受态，涂到三缺培养基上验证相互作用（也可用其他方法验证）10•ATGGCGTCTTACCAGAACCGTCCAGGAGGTCAGGCCACTGACGAGTACGGAAACCCGATCCAGCAGCAGTATGACGAGTACGGAAATCCGATGGGAGGAGGAGGATACGGAACTGGTGGTGGTGGAGGAGCTACAGGTGGCCAAGGATACGGAACAGGTGGCCAAGGGTACGGATCAGGTGGCCAAGGGTACGGAACCGGTGGCCAAGGATACGGAACCGGGACCGGGACTGAAGGCTTTGGAACTGGCGGAGGAGCTAGGCACCACGGCCAAGAGCAACTCCACAAGGAAAGTGGTGGTGGCTTGGGAGGAATGCTTCACCGCTCCGGATCTGGATCCAGCTCTAGCTCGGAGGATGATGGACAAGGAGGGAGGAGGAAGAAGGGAATAACACAAAAGATCAAGGAGAAGTTGCCAGGTCATCATGATCAGTCTGGTCAAGCTCAAGCGATGGGCGGCATGGGATCCGGATATGATGCTGGTGGCTACGGTGGTGAGCACCACGAGAAGAAGGGGATGATGGACAAGATCAAGGAAAAGCTTCCCGGTGGTGGCCGTTAA11应用•发现新的相互作用蛋白质•鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用•建立基因组蛋白连锁图12优点1.快速获得相互作用蛋白质的基因；2.检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况；3.作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤；4.检测的结果可以是基因表达产物的累积效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用；13缺点1.分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工，如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行；2.有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。14二、免疫共沉淀技术1.基本概述2.基本过程3.优缺点15基本概述•免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的、用于研究蛋白质相互作用的经典方法。•原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。16IPandCo-IP•免疫沉淀(IP)是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。•免疫共沉淀(Co-IP)是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。17基本过程非离子去污剂(TritonX-100)裂解细胞在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体proteinA-sepharose孵育SDS-PAGE,western-blotting或质谱仪分析鉴定样品洗脱蛋白复合物1819优点1.它检测的是细胞裂解原液中所有蛋白质与待测蛋白质的相互作用；2.抗原和抗体的相互作用是在生理浓度的条件下被检测的，因此过量表达所带来的假阳性结果可以被排除；3.可以检测到在体内形成的天然复合物；4.依赖于或不依赖于修饰的蛋白质相互作用都可以被检测到。20缺点1.可能检测不到低亲和力及瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；2.两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用，即间接结合的相互作用可能检测不到；3.必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。21三、细胞共定位技术1.基本概述2.基本过程3.优缺点22基本概述•免疫荧光法研究蛋白质与蛋白质之间的细胞共定位•基本原理：将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，在与其相应的抗原或抗体起反应，从而形成的免疫复合物上带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。•用已知的荧光素标记抗体检测相应抗原的方法称为荧光抗体法，用已知的荧光素标记抗原检测相应抗体的方法称为荧光抗原法。23•按照抗原抗体反应的结合步骤，免疫荧光染色方法有：⑴直接法：用荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原结合，以检查出相应的抗原成分。⑵间接法：检测未知抗原时先用特异性抗体与相应抗原结合，洗去未结合的抗体，再用荧光素标记的间接抗体与特异性抗体相结合，形成抗原-特异性抗体-间接荧光抗体的复合物。⑶补体法：用特异性抗体和补体的混合物与标本上的抗原反应，补体就结合在抗原-抗体复合物上，再用抗补体的荧光抗体与补体结合，从而形成抗原-抗体-抗补体荧光抗体复合物。•在研究蛋白质与蛋白质相互作用的实验中，最常用的免疫荧光技术是间接法。抗原即是所要研究的靶蛋白。24基本过程•构建表达载体；•浸染植株，获得抗性苗；•在荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察。25•例：蓝色光激发下融合GFP的A蛋白质定位于细胞核内，显示绿色；在绿色光激发下融合RFP的B蛋白质也定位于细胞核内，显示红色，而不再有细胞质的定位，说明A蛋白质的表达影响了B蛋白质的定位，使之由胞浆、胞核广泛分布，变化为特异性的细胞核定位，而且B蛋白质与A蛋白质具有共同的核定位。26•在另外一些情况下，可能会观察到两种蛋白质单独表达与共同表达的定位结果相同，而且不具有共同的细胞内分布，比如A蛋白质分布在细胞质，B蛋白质分布在细胞核，定位具有明显的差异，但不能因此而断定A蛋白质与B蛋白质不存在相互作用，需要考虑的因素有细胞类型、细胞周期、细胞的生理状态、所受到的外界信号刺激等。某些蛋白质的定位强烈依赖于细胞类型，在一种细胞系内可能定位在细胞质，在另一种细胞系内可能定位在细胞核，需要视具体情况具体分析。27优点•在操作上比较容易掌握，步骤简便，可以随时观察，根据荧光表达的强弱适时选择观察时间。缺点•靶蛋白与荧光蛋白的融合蛋白质必须经过浸染，在植株内表达后，才能观察。28四、GSTpull-down技术•1.基本概述•2.基本过程•3.应用29基本概述•1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase，GST)融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此，GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。30基本过程将诱饵蛋白质和GST标签融合表达，一步纯化后与含有目的蛋白质的溶液培育，之后利用谷胱甘肽-Sepharose将GST-融合蛋白-目的蛋白复合物沉淀下来，然后进行SDS-PAGE，鉴定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质。31应用•鉴定与已知融合蛋白质相互作用的未知蛋白质；•鉴定两个已知蛋白质之问是否存在相互作用。32五、FRET•荧光共振能量转移技术(FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET)检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。•荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。33•原理：当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。34•青色荧光蛋白(cyanfluorescentprotein,CFP)与黄色荧光蛋白(yellowfluorescentprotein,YFP)为目前蛋白-蛋白相互作用研究中最广泛应用的FRET对。CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱相重叠。•将供体蛋白CFP和受体蛋白YFP分别与两种目的蛋白融合表达。当两个融合蛋白之间的距离在5-10nm的范围内，则供体CFP发出的荧光可被YFP吸收，并激发YFP发出黄色荧光，此时通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。35•两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多，检测器所接收到的荧光就越少。•在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。36•优点：（1）蛋白质之间的相互作用是发生在活细胞内，比较完整地反映了蛋白质在生理状态的活动。（2）利用这种方法，可以观察到蛋白质在细胞内的定位。37六、BiFC•双分子荧光互补技术(bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。•在GFP的两个β片层之间的环结构上有许多特异位点可以插入外源蛋白而不影响GFP的荧光活性，BiFC技术正是利用该荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白