省医药卫生科学研究基金申请

1浙江省医药卫生科学研究基金申请书2研究内容和预期成果摘要大肠癌是我国常见的九大恶性肿瘤之一。早期大肠癌患者预后远远高于中晚期患者，而目前到医院就诊的患者中，2／3为中晚期癌，早期大肠癌诊断率还非常低，若能提高早期大肠癌的诊断率，即可明显提高大肠癌的总体治疗效果。因此早发现、早诊断、早治疗，是大肠癌的重要防治策略之一。低分子量的血清蛋白质质谱可以反映组织的病理状态，并有助于肿瘤的早期检测。蛋白芯片表面增强的激光解析离子化-飞行时间-质谱仪（surface-enhancedlaserdesorption/inionation-timeofflight-massspectra，SELDI-TOF-MS）能够获得较大范围的蛋白质质谱，通过它检测健康人，大肠息肉患者，以及大肠癌患者血清中的蛋白质组，应用高等级的数据分析系统（遗传算法，聚类分析），从复杂的血清蛋白质质谱图中分析出本质的变化，并利用人工神经网络建立用于大肠癌的筛检和早期诊断的模型，为筛检大肠癌的高危人群及为临床大肠癌的早期诊断提供新手段、新方法。并为进一步发现新的肿瘤标记物提供了基础。因此，该研究具有良好的理论价值和临床应用价值，可产生巨大的社会和经济效益。主题词1、主题词限填二个；2、主题词之间空一格；3、按《医学主题词表MESH》填写大肠癌蛋白质质谱3二、立题依据（包括国内外研究现状分析、当前需要解决的主要问题等）大肠癌是人类复杂疾病之一，是我国常见的九大恶性肿瘤之一。随着我国经济的发展，大肠癌的发病率与死亡率在我国有上升的趋势，据全国肿瘤防治办公室最近发表的统计结果(1)，大肠癌调整死亡率列为第5位主要恶性肿瘤，在大城市的发病率男性为第三位，女性为第二位。根据欧美和日本等国家几十年内消化道癌谱的变化规律，以及我国各地区近20余年癌症发病率的动态，可以预见大肠癌有可能成为21世纪我国最高发恶性肿瘤之一。由于多种原因，目前到医院就诊的患者中，2／3为中晚期癌，因而尽管近年来大肠癌的诊断、治疗有了长足的进展，但大肠癌的总体疗效并无明显改善，手术后5年生存率仍徘徊在50%左右。而早期大肠癌患者预后较好，5年生存率达90%～100%。但大肠癌病变处于早期时，患者常无临床症状，不会主动就医。早期大肠癌诊断率还非常低，若能提高早期大肠癌的诊断率，即可明显提高大肠癌的总体治疗效果。早发现、早诊断、早治疗，是大肠癌的重要防治策略之一(2)。在非侵入性大肠癌的诊断中常有以下几种方法：①粪便潜血试验，粪便潜血是最为常见的大肠癌早期指征之一，但仅有50％的大肠癌和30％腺瘤隐血试验阳性，假阴性太多，为此不少学者致力于改进隐血试验的方法，如愈创木脂法，免疫隐血试剂法（3）等。其特异性虽然提高了，但敏感性却降低，且费用也增加了。②粪便生化与免疫学试验，应用免疫胶乳清蛋白试剂盒检测粪便中高于正常量的清蛋白，对隐血阴性的大肠癌的检测起到补充的作用(4)，但其在大肠癌中的阳性率为55.4%，腺瘤为27.1%。此外，大肠癌患者粪便中的促腐因子，各种肿瘤伴随抗原和肿瘤相关产物的检测（5－9），在大肠癌早期诊断中也起到一定的帮助。③粪便中癌基因的检测，Doolittle等（10）发现在46－50％的大肠癌病人的粪便中检测到K-Ras基因的突变。Dong等（11）在大肠癌病人的粪便中对TP53,BAT26,andK-Ras基因进行检测也发现有71％的大肠癌中同时发生突变。④血液中肿瘤标记物的检测，Barillari等（12）88例大肠癌患者的血清进行了CEA,TPAandCA19-9的检测，发现它们的敏感性和特异性分别为72%、62%、38%和78%、86%、97%。Nicolini等（13）对90例大肠癌病人的血清进行CEA,TPA,GICA,CA72.4,和CA195的检测，同样发现他们的敏感性与特异性仍徘徊在50－70％之间。⑤血液中癌基因的检测，Hibi等（14）发现在44例大肠癌病人的血清中检测到22例有K-Ras或p53基因的微卫星不稳定性。Salbe等（15）也在35例病人中的血清中发现40％的病人有K-Ras基因的突变。Lauschke等（16）的研究也证实在病人的血清中可检测到K-Ras和APC基因的突变。可见大肠癌早期诊断的方法很多，但均存在特异性与敏感性之间的矛盾，假阳性率和假阴性率高的问题。这也是困扰我们对大肠癌进行早期诊断的最重要的问题。目前国内外对恶性肿瘤早期诊断和筛检方法的研究都在积极进行中，而且很多的早期诊断方法正在进一步的研究证实中，但他们存在的敏感性和特异性之间的矛盾却始终无法完美解决，我们迫切需要一种快速的，高特异性、高敏感性的非侵入性的检测方法，对恶性肿瘤的早期诊断进行研究。表面增强的激光解析离子化—飞行时间—质谱（surface-enhancedlaserdesorption/inionation-timeofflight-massspectra，SELDI-TOF-MS）根本的原理是通过使用特异的探针表面俘获蛋白质表面-增强亲合力（17），是最近两年才发展起来的一种新的蛋白组学的研究方法。SELDI-TOF-MS可以克服二维凝胶电泳存在的内在问题，包括疏水性问题、强酸性、强碱性的蛋白质的分离、膜蛋白的分离问题、低分子量检测的灵敏性、低丰度蛋白质的灵敏性问题（18）。这些质谱仪技术能够直接地从没有预处理的样品中发现生物标志物及蛋白质质谱。样品体积可以低到0.5微升、有利于微量样本的研究。蛋白质只要与SELDI-TOF-MS蛋白质芯片阵列结合,就可通过电离-解吸飞行时间-质谱仪检测，并根据蛋4白质的质量和电荷比(m/z)每一个蛋白质的峰值明显地分离并形成一个蛋白质（保留在芯片上的蛋白质）的图谱。Wright等（19）和Adam等（20、21）用蛋白芯片SELDI-TOF-MS在识别前列腺恶性肿瘤中巳知的标记物，发现了在前列腺癌细胞和体液中过度或者低表达的潜在的标记物。应用SELDI分析从外科手术的组织样品进行激光微切割分离的细胞(健康的细胞和良性的前列腺肥大（BPH）和前列腺上皮内瘤样病变细胞（19、22）和前列腺癌细胞)时，显示他们之间的蛋白质表达有差异。SELDI-TOF-MS也可以在一个很短的时间里从一个小规模的起始样品中获得蛋白质质谱图(19,23),从健康的到良性的到恶变前再到恶性的过程中，从蛋白质分子的指纹图谱可以观察到蛋白质表达的变化。最近的研究已经清楚地显示了前列腺,肺和卵巢的恶性肿瘤的SELDI-TOF-MS蛋白质质谱图（22-25）。另外，从前列腺恶性肿瘤病人的精液中初步分离以后、可以得到一个包括30个缺乏校正的蛋白质的SELDI-TOF-MS质谱图（20），其中的一个精液蛋白质与前列腺癌蛋白质质谱图及良性前列腺肥大蛋白质质谱图比较，发现是精液的一个碱性蛋白质，一个semenogelinI的蛋白水解产物（18）。最近发表在柳叶刀杂志上的一个对卵巢癌患者血清蛋白质的质谱的研究发现（26），每例样本的血清蛋白质质谱均有超过11520个质荷比的峰值，应用高等级的分析方法发现在质荷比为534，989，2111，2251和2645处的五个峰同时变化，对卵巢癌的诊断具有重要意义，该方法的灵敏度为100％，特异性为95％。从上述的研究中，分析蛋白质组学对恶性肿瘤的检测之所以有如此高的特异性与敏感性可能与两个方面相关，第一是蛋白质组学这种方法能够同时反映恶性肿瘤在疾病发生发展过程中细胞内部的遗传特性和当时环境的影响，以及直接在蛋白水平的表达分析，其次蛋白组的生物信息学对蛋白组学的研究起到了极其重要的作用，遗传的聚类算法成功地用于SELDI分布图数据的分析（26，27）、统计算法如不完全的最小二阶乘方和分级聚类已经应用于这些数据的分析（28，29）、离散小波变换（DWT）用于质谱分析法数据的去噪声和数据压缩（30）等。这些高等级的分析方法为蛋白组学的发展提供了良好的基础。我们将利用SELDI-TOF-MS蛋白芯片仪，通过检测健康人，大肠息肉患者，以及大肠癌患者血清中的蛋白质组，结合遗传神经网络模型等生物信息学，找到有意义的蛋白质质谱图，诊断并查出癌前疾病或早期癌，从而进行有效的干预性治疗，并进一步研究大肠癌特异性的肿瘤标记物，具有重要的意义。同时该方法能进一步为其他恶性肿瘤的早期诊断的研究提供有利的条件，使我们能对更多的恶性肿瘤进行有效的治疗和控制。参观文献：（1）、李连弟，鲁凤珠，张思维，等.中国恶性肿瘤死亡率20年变化趋势和近期预测分析.中华肿瘤杂志，1997，19（1）：3-9（2）、YoungGP.Preventionandearlydetectionofcolorectalcancer.LandonWBSounders,1996:241-250（3）、刘希永，郑树，陈坤，等大肠癌序贯筛检方案在人群中应用的前瞻性评估中华流行病学杂志，2000，21（6）285－287（4）、李世荣，张采莲，徐恩迪。粪便序贯隐血与微量白蛋白互补对提高大肠肿瘤筛检率的价值中华肿瘤杂志1995；17：381－383（5）、HuJY,WangS,ZhuJGetal.ExpressionofB7costimulationmoleculesbycolorectalcancercellsreducestumorigenicityandinduesanti-tumorimmunity.WorldJGastroenterol.1999;5:147-151（6）、ZhaoCH,JiangCY,ZhangYYetal.AnalysisofLDHactivitiesanditsisoenzymepatternsincolorectalcancertissues.ChinaNatiJNewGastroenterol1997;3:41-42（7）、GuoWJ,ZhouGD,WuHJ,etal.UltrastructurallocalizationofglutathioneS-transferase-piinhumancolorectalcancercellsWorldJGastroenterol2000;6:454-455（8）、冯相才，黄文，周殿元，等用抗人结肠癌单克隆抗体检测血液和粪便中大肠癌相关抗原的研5究新消化病学杂志，1995；3：36—38（9）、余少平，郑少金，周洪跃单克隆抗体人群大肠癌普查意义再探讨华人消化杂志。1998；6(特刊7)：498（10）、Doolittle,B.R.;Emanuel,J.;Tuttle,C.DetectionofthemutatedK-RasbiomarkerincolorectalcarcinomaJ.Natl.CancerInst.200170(3)289－301（11）、Dong,S.M.;Traverso,G.;Johnson,C.etal.DetectingcolorectalcancerinstoolwiththeuseofmultiplegenetictargetsJ.Natl.CancerInst.200193（11）858－865（12）、Barillari,P.;Ramacciato,G.;deAngelis,R.etal.TheroleofCEA,TPAandCA19-9intheearlydetectionofrecurrentcolorectalcancerInt.J.ColorectalDis.19894（4）230－233（13）、Nicolini,A.;Caciagli,M.;Zampieri,F.UsefulnessofCEA,TPA,GICA,CA72.4,andCA195intheDiagnosisofprimarycolorectalcancerandatitsrelapseCancerDetect.Prev.199519（2）183－195（14）、Hibi,K.;Robinson,C.R.;Booker,S.etal.Moleculardetectionofgeneticalterationsi