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果皮褐变指数果皮失重率和平均散失速率的测定失重率采用称量法，每个样品50g,重复称量3次，取其平均值。失重率（%）=（不同时间样品质量-样品初质量）/样品初质量×100%平均散失速率（%/d）=失重率/存放时间；其中%为散失百分率；d为存放时间（d）1.‘玉石籽’褐变过程中酶促褐变相关酶活性的变化褐变过程中PPO，POD等活性变化。（1）PPO酶活性测定方法①石榴果皮PPO酶液的提取取石榴果皮0.5g，置于研钵中，加入5mL4℃下预冷的pH7.0的磷酸缓冲液（含1%聚乙烯吡咯烷酮和10mmol/L的抗坏血酸）和少量石英砂，冰浴研磨成匀浆，4℃下12000r.min-1离心20min,上清液即为PPO和POD粗提液，4℃保存备用。②PPO活性测定参考张立华等（2007）的方法并改进，向反应管中加入2.95ml(邻苯二酚，浓度为0.2mol/L)，于25℃水浴中平衡3min，取出试管，向其加中加50μL粗酶提取液（以煮过失活的酶液为对照），使用410nm波长处进行酶动力学分析，立即计时，扫描随后2min内溶液在410nm处的吸光度变化，每30s读数一次，共记录5次，然后以每分钟内A410变化0.01为一个酶活性单位(U)。每个样品重复测定3次，取其平均值。③PPO活性计算公式:（2）果皮过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚比色法。POD活性测定参考印芳等(2008)的方法并改进：取上述粗酶液50μL与2.95mLPOD反应液(0.125mL愈创木酚+0.255mL30%H2O2，用pH7.0磷酸缓冲液稀释至250mL)，使用紫外分光光度计在470nm波长下比色，每隔1min记录1次吸光度，共记录5次，然后以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位(U)。每个样品重复测定3次，取其平均值。酶活性=(△A470×VT)/(W×VS×0.01×t)。(2)式(2)中，△A470为470nm条件下，反应时间内吸光值的变化；VT为酶液总体积(mL)；W为试验材料鲜质量(g)；VS为测定时所取的酶液体积(mL)；t为反应时间(min);酶活性单位为U·min-1g-1FW酶活测定所需试剂配制方法：（1）pH7.0的磷酸缓冲液：参照植物生理学实验指导用书配制。（2）pH7.0的磷酸缓冲液（含1%聚乙烯吡咯烷酮和10mmol/L的抗坏血酸）：1000ml的pH7.0磷酸缓冲液中加入10g聚乙烯吡咯烷酮和1.761g抗坏血酸溶解即可。(3)0.2mol/L邻苯二酚溶液称取11g邻苯二酚用500mLpH=7.0的磷酸缓冲液溶解。(4)POD反应液0.125mL愈创木酚+0.255mL30%H2O2，用pH7.0磷酸缓冲液稀释至250mL.测定酶促反应底物含量变化2.果皮总酚含量取1g石榴果皮研磨成匀浆，加入20ml60%的乙醇于50ml三角烧瓶中，超声波60℃提取40min，后过滤至25ml容量瓶并定容（60%的乙醇）测定时取1ml0.5mol/L的福林酚试剂加入50微升提取液振荡混匀，再加入4ml0.5mol/L的Na2CO3溶液室温下反应60min，后于750nm比色测定其吸光值A750。以没食子酸为标准制作标准曲线。果皮总酚测定所需试剂配制方法：（1）60%的乙醇：取60ml纯乙醇用蒸馏水定容至100ml即可。（2）0.5mol/L的福林酚：购买福林酚（酚测定2mol/L）用蒸馏水稀释至0.5mol/L.(3)0.5mol/LNa2CO3：称取53gNa2CO3加蒸馏水定容至1000ml。（4）没食子酸为标准制作标准曲线:精密称取没食子酸标准品0.010g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，得浓度为0.1mg/mL，取此溶液5mL定容到10mL,浓度为0.05mg/mL。分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0mL于10mL容量瓶中，分别加入福林酚试剂1mL，混匀，在0.5～8min内加入4mL0.5mol/L的Na2CO3溶液，充分混合后定容，室温下放置60min，以空白试剂为对照，750nm下测定吸光值，每个样品平行测定三次。由吸光值对浓度回归，求得标准曲线。3.DPPH自由基清除法测定抗氧化活性取2方法制备的酚类物质提取液2.0ml，再加入0.8mmol/LDPPH试剂2.0mL,强烈振荡后静置30min，以无水乙醇为空白，于517nm处测定反应液的吸光度值。按下式计算DPPH清除率：DPPH清除率（%）=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100Ai为提取液与DPPH试剂混合液的吸光值；Aj为提取液与无水乙醇混合液的吸光值；Ao为DPPH试剂与无水乙醇混合液的吸光值。试剂制备方法：0.8mmol/LDPPH：准确称取0.0315gDPPH，用无水乙醇溶解，并定量转入100mL容量瓶中，摇匀，置于冰箱中冷藏备用。DPPH稳定性不好，要用时,新鲜配制非酶促反应超氧自由基产生速率制作标准曲线：取KNO2标准液（100μmol/L）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，分别放入试管中，加蒸馏水至1mL,依次加入1mL50mmol/LpH7.8磷酸缓冲液，1.0mL1mmol/L盐酸轻胺溶液,混匀,于25C保温1h。取出后分别加入1.0mL17mmol/L对氨基苯磺酸溶液和l.0mL7mmol/La-萘胺，混匀后于25℃保温反应20min。以0号管为参比空白调零，测定显色液在波长530mn处的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，超氧阴离子物质的量（μmol）为横坐标，绘制标准曲线。测定：取果皮液氮粉2g加入5mLpH7.8磷酸缓冲液，冰浴匀浆，4℃下10000×g离心20min，取上清液，按照与制作标准群贤的方法进行测定。以不进行保温1h的定作为参比对照。计算结果：根据样品管与对照管的吸光度差值查标准曲线，求出相应的超氧阴离子的含量，按下式计算：超氧阴离子产生速率(nmol/min.g)=n.V.1000/(Vs.t.m)式中:n：测定液中超氧阴离子的物质的量（μmol）；V：样品提取液总体积(mL)；Vs：吸取样品液体积(mL)；t：样品与羟胺反应的时间(min)；m:样品质量(g)。试剂配制方法：1mmol/L盐酸轻胺溶液17mmol/L对氨基苯磺酸溶液(以冰醋酸：水=3：1配制)7mmmol/La-萘胺（以冰醋酸：水=3：1配制)100μmol/LKNO2溶液：0.85gKNO2，用蒸馏水溶解定容至10ml，吸取上述溶液0.1ml至1000ml容量瓶，用蒸馏水定容至刻度线。丙二醛含量测定细胞膜脂过氧化作用的产物之一参照《植物生理学实验指导用书》称取果皮液氮粉0.5g放入研钵，加少许石英砂，5%TCA3ml研匀，定容至10ml，900×g离心10min，常温保存。取2ml酶液（以TCA代酶液作对照）放入长试管中，加入8mlTBA，沸水浴10min，迅速冷却，放入离心管在900×g离心20min，上清液为样品提取液。显色反应和测定吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml0．6％TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450nm波长下的吸光度。方式中，Ｖ：样品提取液总体积（ｍｌ）；ａ：测定时取样体积（ｍｌ）；Ｗ：样品干重。5％三氯乙酸溶液（ＴＣＡ）：称取5g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到100ml；0.6％硫代巴比妥酸溶液（ＴＢＡ）：称取0.6g硫代巴比妥酸，用5％三氯乙酸溶解，定容至100ml糖含量的变化与褐变指数的关系①还原糖测定方法羰基褐变是非酶促褐变的重要途径，还原糖作为羰基反应的直接反应物，其含量的变化对非酶促褐变有较大影响，还原糖是呼吸基质，其含量的变化大小也反映了生理生化的代谢强弱及采后腐烂的程度。采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法。具体方法如下：取2g果皮液氮粉，分两次加入5mL0.05mol/L的pH7.0的磷酸盐缓冲液，于研钵中研成匀浆，转入离心管离心10min（4000rpm/min），取上清液1mL，加蒸馏水1mL，加入1.5mL3,5-二硝基水杨酸。沸水浴中加热5min，立即冷却至室温，蒸馏水定容到25mL，测540nm处的吸光度。3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS)的配制方法为：准确称取3.15g3,5-二硝基水杨酸，溶于150mL浓度为2mol·L-1的NaOH溶液中，加到250mL含有124.2g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加2.5g结晶酚和2.5g亚硫酸钠。冷却后加水定容至500mL，贮于棕色瓶中。1mg/mL葡萄糖标准液的配制方法为：称取100mg分析纯葡萄糖(预先在80℃烘至恒重)，用蒸馏水溶解后转移到100m1容量瓶中，定容至刻度，放置在冰箱中保存备用。还原糖含量标准曲线的制作：取6支25mL的刻度试管，依次加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的葡萄糖标准液，补加蒸馏水至体积为2mL，再往每支刻度试管中加入1.5mL的3,5-二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5min，立即用自来水冷却，用蒸馏水稀释至25mL，摇匀后，测定540nm处的吸光值。样品测出吸光值后，根据标准曲线算出样品的还原糖含量，单位用mg/gDW表示。0.05mol/LpH7.0磷酸缓冲液：配制参照植物生理学实验指导用书。2mol·L-1的NaOH溶液：称取20gNaOH，蒸馏水溶解，定容至250mL。氨基酸的非酶促褐变反应活性的研究（石榴果皮褐变前后氨基酸含量测定和分析）双指示剂甲醛滴定法（=U3dyCNugNWrBjznwCgOeBTxkzFcvxg-7PPES8jCI7oBVTTMD3Vy77pK-_u7bcAVSoBonEDKgLwxVubIedVdYra）取相同的两份样品2g，冰浴研磨，加水10mL，3000r/min离心10min，取上清液用活性炭脱色，然后过滤得到上清液，分别注入100mL三角烧瓶中，其中一份加入中性红指示剂2-3滴，用0.1M的NaOH溶液滴定终点(红色一黄橙色)，记录用量Vl；另一份加入百里酚酞3滴和中性甲醛20mL，摇匀，静置1min，用0.1MNaOH溶滴定至淡蓝色为终点(无色-蓝色)，记录用量V2。氨基酸态氮(%)=（(V1-V2)×N×0.014）×100/W式中：V2为用百里酚酞为指示剂时标准碱液消耗量(mL);V1为用中性红作指示剂时碱液的消耗量(mL);N为标准碱液摩尔浓度;W:样品的重量(g)。0.014：氮的毫克当量。配制试剂注意事项：（1）0.1%百里酚酞95%乙醇溶液。（2）0.1%中性红50%乙醇溶液。（3）0.1MNaOH标准溶液：称取4gNaOH蒸馏水溶解，定容至1000mL，标定后使用。5-羟甲基糠醛含量测定（=5ZRo3W3J8JGpTercKjN1SdK6lovVwV73ohDNYpQSNHiQQfPjYjAgEpDJL5I0F_Wo8mm2aNJ8L-elDDmM678YS_2hLW_FmpGNqSBMP4wofFG）参考阮卫红[10]的方法，略有改进。称取5g样品捣碎匀浆，放入50mL容量瓶中，加水25mL，用移液管分别加入1mL亚铁氰化钾溶液和1mL硫酸锌溶液，用蒸馏水定容到刻度，摇匀后静置10min，过滤并收集滤液。准确移取2mL待测液，加入５mL对甲基苯胺、１mL巴比妥酸，混匀后迅速倒入比色皿中，在550nm波长下测定吸光度值。分别配制0、2、4、6、8g/mL的羟甲基糠醛标准溶液，按照相同的方法制作标准曲线。5-HMF计算公式为：5-HMF含量(μg/g)=m1×v1v2×ｍ０注：m0表示样品的质量/g；m1表示从标准曲线上查得的羟甲基糠醛的含量/μg；v1表示测试溶液总体积/mL；v2表示测定时所取样品的体积/mL巴比妥酸溶液：500mg巴比妥酸在温水浴中溶解，冷却后在容量瓶中定容至100ml。最好在冰箱中保存，保存期为一个月。对甲苯胺溶液：10.0g的对甲苯胺用10.0m