石蜡切片的制作.

22:181石蜡切片的制作22:182植物制片的基本步骤•1、取材•2、杀死、固定、保存•3、脱水、置换•4、渗透、包埋•5、切片、粘片•6、染色、封固需要时间长（十几天），但可长期保存。22:183•1.取材•材料来源及部位。•①种类：•②部位：•③年龄或发育阶段•④是观察横切面还是纵切面？22:184取材原则：•动作------快，轻，用力均匀•体积合适•刀要锋利22:185•2.固定•目的---保持原来的结构•固定液•固定时间•固定后的处理22:186名称优点缺点95%酒精材料固定后无需冲洗就可以脱水，使用简便，固定糖原和核酸原生质收缩，但仍然能保持细胞壁的形状甲醛福尔马林市面出售为饱和液，浓度为40%，又称福尔马林，是很好的硬化剂，材料易收缩。渗透力慢。与酒精混合，可以阻止材料过于坚硬冰醋酸H3COOH渗透力强而快，能溶解脂肪，可保存蛋白质不变质，是染色体很好的保存剂组织发胀，可阻止酒精、甲醛等引起的收缩22:187锇酸OsO4能良好固定细胞的细微构造，是脂肪类的唯一固定剂。用于电镜的超薄切片中作为主要的固定剂。是目前最昂贵最好的固定剂。渗透力很弱，所以材料越小越好。名称优点缺点戊二醛常用的非凝固型固定剂。特点：固定蛋白质；可以部分保持酶和蛋白质的活性。固定能力比甲醛强。常用于电镜制片的固定。不能保存脂肪，对细胞膜的显示较差。22:188混合固定剂•固定组织时，单独使用一种固定剂很难对组织成分有理想的固定效果。通常几种固定剂混用，制成混合固定剂。以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。22:189F.A.A固定液•最常用的固定液。固定时间，不受限制，短为24小时，长可延至数月或数年。•[配法]－－－－50％或70％酒精－－90毫升冰醋酸－－－－－－5毫升福尔马林－－－－－5毫升柔软材料用50％酒精，坚硬材料用70％酒精配制。22:1810卡诺氏(Carnoy‘s)固定液有极快的渗透力，•固定根尖和花药只需40-60分钟，时间太长不好(不能超一天)。•固定后用95％酒精冲洗，在组织不能立即处理时，需转入70％酒精中保存。配法有两种：22:1811•4%多聚甲醛---0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）配制•该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，继续浸泡固定2～24h（4度）。•另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。22:1812配制方法•称取40g多聚甲醛，加入500～800ml0.1mol/L磷酸缓冲液，加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1MNaOH才能使溶液清亮，最后定容1000ml，充分混匀。22:1813固定组织时应注意：•①保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。•②组织块不易过大过厚，厚度必须控制在0.3cm以内。•③固定液必须有足够的量，一般大于组织20倍以上。•(4)抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内气泡的干扰22:1814固定时间的选择•不同的固定液。•材料的大小，组织的特性与致密度。•温度的不同。22:1815组织固定后的处理•冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。•修块:大小合适、去除形态不好的部分，•材料经过固定后，需要保存下来以备利用，通常使用的保存剂是70%的酒精溶液，可以使一般的材料保存较长的时间而不至于变坏。•通常在4度冰箱中存放。22:18163.洗涤与脱水•固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。•水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进入。22:1817•凡用酒精配制的固定液，一律用同浓度的酒清洗。•酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行.•30%--50%---70%---85%---95%--100%---100%每步30-60分钟左右。22:1818要求及注意：•保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净，•不同大小的组织块脱水时间不同。•不能过度脱水（过久使组织变脆,收缩）•在酒精中加入曙红，用于染色。•材料可以放在70％酒精中保存，•正丁醇、叔丁醇、丙酮等也可做脱水剂。22:18194.透明•纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。•常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。22:1820•通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。•材料进入无水的透明剂中后，若透明剂变浑浊，说明材料中的水分未脱干净，必须回到前面一级无水的脱水剂中再次脱水（但是效果往往不好）。•透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及组织特性而定。•如果透明时间过短或者过长，都不合适。22:18215.浸蜡与包埋•用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。•通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时或者过夜，再先后移入熔化的石蜡液中浸渍几天•浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。22:1822•石蜡特点：熔点：45-50℃软蜡•55-60℃硬蜡•材料较硬的，用熔点较高的石蜡包埋；•切片较薄时（在8微米以下），用熔点较高的石蜡包埋；•夏季采用熔点较高的石蜡（56,58）,冬季宜选用熔点较低的石蜡（52,54）。22:1823石蜡的处理：•新蜡应溶一次，增加密度。•并用滤纸过滤去处杂质。•加5%~10%的蜂蜡,增加石蜡的韧性。•反复溶的旧蜡包埋效果更好。•如果将2-3种不同熔点的石蜡混合使用效果好。22:1824•程序：在溶蜡箱中进行55-60℃，恒温。•浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯：石蜡（1：1）中1次，在石蜡中2次，每次1-3天左右。•包埋：在室温进行22:18256.切片•包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，附于小木块上，22:182622:1827•切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。•通常切片厚度为8～12微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。22:18287.贴片与烤片•用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后操作中使材料脱落•在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥22:1829常用的粘片剂－郝伯特(Haupt)粘贴剂：动物胶(明胶)1克水100毫升甘油15毫升石碳酸2克22:1830•注意问题：•使用时明胶液不能多。•粘贴时注意蜡片的方向（光面向下）•展片台的温度如果超过45℃以上，载玻片上的蜡就会熔化，以后的脱蜡困难，难以染色！而且材料会发脆。22:18318.脱蜡及水化•干燥后的切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色。•用二甲苯脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。•脱蜡及以后过程中，必须时时知道材料位于载玻片的哪一面！22:1832•其顺序如下----二甲苯→1/2二甲苯+1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→30％酒精→水→染色以上各级约需5～10分钟。22:18339.染色•染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色和足够强的差异以便于观察。•经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不同类型的细胞组织。•根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染色方法。22:1834(1)天然染料•A、苏木精•也叫苏木色精，源于苏木科植物苏木的心材。•多色性，需媒染；•配制后需充分氧化•遇酸呈红色，遇碱呈蓝色。•常用配方：海氏苏木精。22:1835•B、洋红•取自胭脂虫雌虫体，为酸性染料。•特点：渗透力强；一般用于涂抹制片。可将核及染色体染成•深红色。22:1836(2)煤焦染料A、番红•植物组织学常用染料。碱性；常用于与固绿、亮绿、苯胺蓝对染，或与结晶紫、桔红G进行三重染色。•其中以番红-O为最好。•染色效果：木化细胞壁红色，角化细胞壁粉红色，栓化细胞壁黄褐色，染色体、核仁、中心体红色。22:1837B、亮绿•酸性染料；可将细胞质和纤维素壁染成绿色。•可与番红对染。C、固绿•酸性染料；特点与亮绿类似。色彩不如亮绿鲜艳，但不易褪色22:1838J、甲苯胺蓝-O（TBO）•酸性染料。•常与番红或真曙红进行二重染色。染纤维素，细胞壁，鞭毛等。22:1839复合染色法•番红与固绿染色法•番红用l％的水溶液，固绿用0.5％的酒精液(用95％的酒精配制)，染色步骤如下：•1.番红水液番红0.1g溶入蒸馏水,定溶至100ml。2.番红酒液番红0.5g或1g溶入50%酒精,定溶至100ml。22:1840TBO整体染色•1烘干的切片放入0.5％TBO,10-30s(易染色过深)•TBO配制--0.5％TBO溶在2.5％Na2CO3•2流水冲洗10mins，•3蒸馏水洗，烘干过夜•4烘干的石蜡切片脱蜡（放入纯二甲苯I中10mins，再转入纯二甲苯II中10mins），树脂封片22:184110.切片脱水、透明和封片•染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在95％及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短在酒精中的时间，以免脱色。•二甲苯透明后，滴加适量（1～2滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡。22:1842•封片•加拿大树胶（Canadabalsam）•溶于二甲苯中成为——二甲苯-加拿大树胶液。绝对不能混入水和酒精，否则树胶回浑浊，不能观察。22:1843•将载玻片从二甲苯中取出，务必使有材料的一面朝上。•迅速在材料上加适量封固剂，封固剂最好正正地滴在材料上（不能使二甲苯干很久后才封片）。22:1844•石蜡制片程序及环节繁多，需数日才能完成1个周期，但切片可长期保存，供教学、科研。•优点：操作比较简便、容易，可以切出较薄的切片，并且易于制成连续切片，也容易附着于载玻片上。•缺点：不适于较大的标本，材料在经过脱水、浸蜡的过程中容易收缩。22:1845石蜡切片技术取材→固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→粘片→烘干→脱蜡→复水→染色→透明→封片材料的处理水→乙醇→二甲苯→石蜡→二甲苯→乙醇-水