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实验1糖类的提取分离与薄层层析分析实验简介：薄层层析(thinlayerchromatography,TLC)是在吸附剂或支持介质均匀涂布的薄层上进行的，是一种广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂肪酸、脂肪类、糖类、磷脂和生物碱等多种物质的分离和鉴定的层析方法。本实验是从水果中提取单糖、双糖和多糖组分，采用硅胶G薄层层析法分析糖类成分。一、实验目的1．了解并初步掌握从水果中分离提取单糖、蔗糖及淀粉的原理。2．学习薄层层析的一般操作及定性鉴定的方法。二、实验原理1．单糖及多糖的提取凡不能水解为更小分子的糖即为单糖。单糖种类很多，其中以葡萄糖分布最为广泛，存在于各种水果、谷类、蔬菜和动物血液中。由于单糖分子中有多个羟基，增加了它的水溶性，尤其在热水中溶解度很大；在乙醇中也有很好溶解性，但不溶于乙醚、丙酮等有机溶剂中。而蔗糖等双糖分子也易溶于水和乙醇中。因此，单糖和双糖一般可用热水或乙醇将其提取出来。多糖是由多个单糖分子失水缩合而成的大分子化合物。在自然界中分子结构复杂而多种多样，有不溶性的结构多糖如植物纤维素、半纤维素，动物的几丁质等；另有一些为贮存物质如淀粉、糖原等；还有一些多糖具有复杂的生理功能。多糖中的淀粉不溶于冷水及乙醇，但可溶于热水中形成胶体溶液。因此可以用乙醇提取单糖及低聚糖，然后提取淀粉等多糖。2．薄层层析薄层层析的主要原理是根据各组分在溶剂中的溶解度不同和吸附剂对样品各组分的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列的斑点。糖的分离鉴定可用吸附层析或分配层析，吸附层析常用的吸附剂为硅胶，分配层析常用的支持剂是硅藻土。在吸附剂或支持剂中添加适宜的黏合剂后再涂布于支持板上，可使薄层粘牢在玻璃板(或涤沦片基)这类基底上。硅胶G是一种已添加了黏合剂—石膏(CaSO4)的硅胶粉，糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的相对分子质量和羟基数等有关，经适当的溶剂展开后，糖在硅胶G薄板上的移动距离为戊糖＞己糖＞双糖＞三糖。若采用硼酸溶液代替水调制硅胶G制成的薄板可提高糖的分离效果。薄层层析的展层方式有上行、下行和近水平等。一般常采用上行法，即在具有密闭盖子的玻璃缸(即层析缸)中进行，将适量的展层溶剂倒于缸底，把点有样品的薄层板放入缸中即可(如图1所示)。保证层析缸内有充分展层溶剂的饱和蒸汽是实验成功的关键。图1密闭式展层缸1．缸盖2．层析缸3．薄层板4．点样处5．展层溶剂三、实验用品1．实验材料：新鲜葡萄或苹果。2．实验试剂(1)标准糖溶液：取果糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖，分别用75％乙醇配制成10mg/mL溶液。(2)标准糖混合溶剂：取上述各种糖，混合后用75％乙醇配制成10mg/mL溶液。(3)0.1mol/L硼酸(H3BO3)溶液。(4)展层溶剂：①乙酸乙酯：乙酸：水＝2：1：1；②氯仿：甲醇=60：40(V/V)。(5)苯胺-二苯胺显色剂：1g二苯胺，1mL苯胺和85%5mL磷酸溶于50mL丙酮。(6)1mol/LH2SO4(7)1％碘-碘化钾(I-KI)溶液：将碘化钾20g及碘10g溶于100mL蒸馏水中，使用前需稀释10倍。(8)BaCO33.实验器材电吹风，层析缸(带密封盖)，烘箱，硅胶G，毛细管(Ф0.5mm)，喷雾器，干燥器，玻璃板(5×10cm)，玻璃棒，烧杯，直尺，铅笔。四、实验操作1．糖类的提取：(1)还原糖及蔗糖的提取称取25g新鲜葡萄(去核)或苹果，将其磨碎后转入250mL三角烧瓶中，加入80％乙醇50mL，放在50℃水浴中抽提30min。5000r/min离心10min，收集上清液，沉淀用85％乙醇适量再提取1～2次(视样品不同而定反复抽提的次数)。收集合并所有上清液，沉淀部分烘干留待提取测定淀粉等多糖用。(2)淀粉的水解取乙醇提取后的沉淀物0.5g，放入三角烧瓶中，加20mL1mol/LH2SO4，盖上表面皿，在沸水浴锅中加热水解，并经常摇动，1.5～2h后，取一滴水解液放在白瓷板上，加1滴1％I-KI溶液，检查淀粉是否水解完全，如为紫蓝色，则说明水解不完全，再继续水解0.5h，直至水解液对I-KI不显色为止。样品冷却后，小心将三角烧瓶中的水解液转移至100mL烧杯中，并用蒸馏水冲洗三角烧瓶3次，加BaCO3中和至中性，过滤或离心，上清液水浴蒸发浓缩后用于TLC分析。2．硅胶G薄层层析分析(1)硅胶G薄层板的制备：将制备薄层用的玻璃板预先用洗液洗干净并烘干，玻璃板要求表面光滑。称取硅胶G粉6g，加入12mL0.1mol/L硼酸溶液，用玻棒在烧杯中慢慢搅拌至硅胶浆液分散均匀、黏稠度适中，然后倾倒在干净、干燥的玻璃板上，倾斜玻璃板或用玻棒将硅胶G由一端向另一端推动，使硅胶G铺成厚薄均匀的薄层。待薄板表面水分干燥后置于烘箱内，待温度升至110OC后活化30min。冷却至室温后取出，置于干燥器中备用(注意：避免薄板骤热、骤冷使薄层断裂或在展层过程中脱落)。制成的薄层板，要求表面平整，厚薄均匀。(2)点样：取制备好的薄板一块，在距底边1.5cm处划一条直线，在直线上每隔1.5～2cm作一个记号(用铅笔轻点一下，不可将薄层刺破)。用管口平齐毛细管吸取标准样(葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖)及糖的提取和水解液量约5～50μg，点样体积约1～5μl,可分次滴加，控制点样斑点直径不超过2mm。在点样过程中可用吹风机冷热风交替吹干样品。(3)展层：将已点样的薄板点样一端放入盛有展层溶剂的层析缸中，展层溶剂液面不得超过点样线，层析缸密闭，自下向上展层，当展层溶剂到达距薄板顶端约lcm处时取出薄板，前沿用铅笔或小针作记号。60℃烘箱内烘干或晾干。(4)显色：将苯胺-二苯胺显色剂均匀喷雾在薄层上，电吹风加热至层析斑点显现，此显色剂可使各种糖显现出不同的颜色。五、结果样品中糖的定性鉴定，薄层显色后，根据各显色斑点的颜色相对位置，测算Rf值。将混合样品图谱与标准样品图谱相比较或通过混合样品与标准样品Rf值的比较，确定混合样品中所分离的各个斑点分别为何种糖。六、注意事项1．自植物中提取糖类时，一般都是利用水和醇进行抽提。因此能溶于水的色素、蛋白质、丹宁、果胶、有机酸等也会随同糖二起被提取出来，从而干扰糖的分析。为了除去干扰物，常需使用澄清剂，如中性醋酸铅、碱性醋酸铅、氢氧化钡等。2．植物体内有许多能水解糖的酶，因此在分离糖时必须适当地破坏或抑制酶的活性，方能提取天然状态下的糖类。比如采集的新鲜材料应迅速加热干燥或冷冻保存等，使用新鲜材料提取时，宜用沸水和提高乙醇的浓度至85％；如果材料的脂类和色素很高，可用石油醚浸提除去脂和色素。3．由于糖是多羟基化合物，极性强容易吸附，故多采用含无机盐水溶液制备硅胶薄板，使硅胶薄层吸附能力降低，斑点集中，对分离有所改善，样品承载量也可有显著提高。4．制备薄板时，薄板的厚度及均一性对样品的分离效果和Rf的重复性影响很大，普通薄层厚度以250μm为宜。若用薄层层析法制备少量的纯物质时，薄层厚度可稍大些，常见为500～750μm，甚至1～2mm。5．活化后的薄层板在空气中不能放置太久，否则会因吸潮降低活性。6．用于薄层层析的样品溶液的质量要求非常高，样品中必须不含盐，若含有盐分则会引起严重的拖尾现象，甚至有时得不到正确的分离效果。7．样品溶液应具有一定的浓度，一般为1～5μg/μl,样品太稀，点样次数太多，就会影响分离效果，所以必须进行浓缩处理。七、作业1．薄层层析与其他层析法比较有哪些优点？2．本实验在操作过程中有哪些方面是实验成功的关键?3．分析本实验的层析图谱。