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碱性磷酸酶的提取及其比活性测定实验报告班级：12级生物一班小组成员：陈明珠、邓家颖、范洁婷、梁彦珺指导老师：许华1、实验原理本实验采取有机溶剂沉淀法从猪肝匀浆液中提取分离碱性磷酸酶(AKP)。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33％的丙酮或30％的乙醇中，而不溶于终浓度为50％的丙酮或60％的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。根据国际酶学委员会规定，酶的比活性(specificactivity)用每mg蛋白质具有的酶活性单位(u/mg·pr)来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：(1)每ml样品中的蛋白质mg数(mg/m1);(2)每ml样品中的酶活性单位数(u/ml)。酶的纯度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位(King-Armstrong法)可定义为：在37℃保温15min每产生lmg的酚为一个酶活性单位（U）。样品中蛋白质含量测定用考马斯亮蓝法测定。2、实验试剂1．0.5mol/L乙酸镁溶液：称取乙酸镁107.25g溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。2．0.1mol/L乙酸钠溶液：称取乙酸钠8.2g溶于蒸馏水中，稀释到1000ml。3．0.01mol/L乙酸镁-0.01mol/L乙酸钠溶液：取0.5mol/L乙酸镁溶液20ml及0.1mol/L乙酸钠溶液100ml，混合后加蒸馏水稀释到1000ml。4．0.01mol/LTris-0.01mol/L乙酸镁pH8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，用蒸馏水溶解并稀释至1000ml，即为0.1mol/LTris溶液。取0.1mol/LTris溶液100ml，加蒸馏水约800ml，再加0.5mol/L乙酸镁溶液20ml，混匀后用1％乙酸调pH至8.8，用蒸馏水稀释至1000ml即可。5．丙酮(分析纯)6．95％乙醇(分析纯)7．正丁醇(分析纯)8．0.04mol/L底物液：称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2·2H2O)15.16g或磷酸苯二钠(无结晶水)8.72g，用煮沸冷却的蒸馏水溶解，稀释至1000ml。加氯仿4ml盛于棕色瓶中，冰箱内保存，可用一周。9．0.01mg/ml酚标准液：称取重蒸酚l00mg，用pH8.8Tris液配制成100ml，临用前稀释100倍。10．0.5mol/LNaOH11．0.3％4-氨基安替比林：称取4-氨基安替比林0.3g及碳酸氢钠4.2g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml，置棕色瓶中冰箱保存。12．0.5％铁氰化钾：称取铁氰化钾5g和硼酸15g，各溶于400ml蒸馏水中，溶解后两液混合，再加蒸馏水至1000ml，置于棕色瓶中，暗处保存。3、实验器材1．研钵2．刻度离心管3．移液管4．电动离心机5．玻璃漏斗和玻棒6．托盘天平7．恒温水浴8．石英比色皿9.725型分光光度计3、操作步骤3.1AKP的提取(1)取2g新鲜猪肝，剪碎后加入0.01mol/L乙酸镁-0.0lmoL/L乙酸钠溶液2.0ml，研磨成匀浆。将匀浆倒人刻度离心管中，记录其体积VA，此为A液。吸取A液0.1ml于另一试管A1中，加pH8.8Tris缓冲液1.9ml稀释，此为稀释A1液(1：20)，供测比活性用。再取A液0.1ml于另一试管A2中，加生理盐水4.9ml稀释，此为稀释A2液（1:50），此供测蛋白质含量用。(2)在剩余A液中加入正丁醇2.0ml，用玻棒充分搅拌2至5min，室温放置30min，用滤纸过滤，滤液置于刻度离心管中，加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心(2000r/min)5min，弃上清液，沉淀加入0.5mol/L乙酸镁4.0ml，用玻棒充分搅拌使其溶解，记录其体积VB，此为B液。取B液0.1ml于另一试管中，加人pH8.8Tris缓冲液1.9ml，此为稀释B液(1：20)，供测比活性用。再取B液0.1ml于另一试管B2中，加生理盐水4.9ml稀释，此为稀释A2液（1:50），此供测蛋白质含量用。剩余B液记体积VB’。（3）在剩余B液中加入96%的冷乙醇0.45VB’，混匀，离心（2500r/min）5min，弃沉淀。上清液入离心管，记体积VB”，加0.83VB”96%冷乙醇，混匀，离心2500rpm，5分钟。弃上清，沉淀加0.01MMg(Ac)2-0.01MNaAc混合液4ml，搅拌，记体积VC，此为C液。吸取C液0.1ml于另一试管C1中，加pH8.8Tris缓冲液0.9ml稀释，此为稀释C1液(1：10)，供测比活性用。再取C液0.1ml于另一试管C2中，加生理盐水0.4ml稀释，此为稀释C2液（1:5），此供测蛋白质含量用。剩余C液记体积VC’。(4)在剩余C液中加入冷丙酮0.5VC’，混匀，离心（2000r/min）5min，弃沉淀。上清液入离心管，记体积VC”，加1/3VC”冷丙酮，混匀，离心2000rpm,5分钟。弃上清，沉淀加0.01MMg(Ac)2-0.01MNaAc混合液5ml，搅拌，记体积VD，此为D液。吸取D液0.1ml于另一试管D1中，加pH8.8Tris缓冲液0.9ml稀释，此为稀释D1液(1：10)，供测比活性用。剩余D液入D2管，直接待测蛋白质含量。3.2AKP的比活性测定(1)AKP的活性测定：取试管5支，按表1操作：表1试剂mlB1234A1稀释液—0.1———B1稀释液——0.1——C1稀释液———0.1—D1稀释液————0.1pH8.8Tris缓冲液0.1————0.04mol／L底物液1.01.01.01.01.00.5mol/LNaOH1.01.01.01.01.00.3%4-氨基安替比林1.01.01.01.01.0立即混匀，37℃水浴预温15min0.5%铁氰化钾2.02.02.02.02.0混匀，终止酶促反应，室温放置10min后，B管试剂调零，510nm处测吸光度，记录各管OD。做一只酚标准管：依次加入0.1mlpH8.8Tris缓冲液、1ml0.01mg/ml苯酚标准液、1ml0.5mol/LNaOH、1ml0.3%4-氨基安替比林。混匀，510nm处测吸光度。(2)蛋白质含量测定：取3支试管，按表2操作：表2试剂mlB1234生理盐水0.1————A2稀释液—0.1———B2稀释液——0.1——C2稀释液———0.1—D溶液————0.1考马斯亮蓝试剂5.05.05.05.05.0混匀。2分钟后，B管试剂调零，595nm处测吸光度，记录各管OD。用牛血清蛋白制数只不同浓度的标准蛋白溶液，用考马斯亮蓝法测得其分光光度，并得到标准曲线表。4、计算方法测定管的吸光度1)每ml待测酶液中AKP活性单位数(U/ml)=×标准管的酚含量标准管的吸光度×稀释倍数2)待测酶液中蛋白质浓度(mg/m1)=查标准曲线表所得值×稀释倍数每ml待测酶液中AKP的活性单位数（U）3）AKP的比活性(U/mg)=每ml待测酶液中蛋白质的毫克数（mg）4）总蛋白量(mg)=蛋白质浓度(mg/ml)×总体积(ml)5）酶总活性单位数(U)=AKP活性单位数(U/ml)×总体积(ml)6）纯倍数计算=各阶段AKP比活性数(U/mg)÷A液的AKP比活性数(U/mg)7）得率(%)=各阶段酶的总活性单位数(U)÷A液中酶的总活性单位数(U)×100%5、实验结果测得表一各管OD值如下：试剂B1234OD00.1520.2100.0930.342苯酚标准管测得吸光度为0.02A表二各管OD值如下：试剂B1234OD01.9891.1510.8650.799标准蛋白曲线得出y=60.333x+0.028，其中y为吸光度（A），x为标准蛋白质量（mg）经过计算得出下表：19343.798.7－得率(%)4.6671.52.5－纯化倍数0.0280.0090.0150.006比活性（U/mg）10.262.3255.255.32总AKP活性单位（U）1．710.4651．050.76AKP活性单位（U/ml）366.96261.08347.355840.21总蛋白量（mg）61.1652.21669.471120.030蛋白含量（mg/ml）6557总体积（ml）第三次丙酮提取（D液）第二次乙醇提取（C液）第一次丙酮提取（B液）匀浆A液6、注意事项1．在纯化过程中，各步加入的有机溶剂量要计算准确；2．加入有机试剂混匀后应立即离心，不宜放置过久；3．在测定酶活性时，每加入一种试剂须立即混匀，避免浑浊；4、低温条件进行，避免酶失活；5、乙醇上层液入回收瓶。7、小组讨论1、猪肝提取效果与兔肝有所区别，实验流程有待改良；2、AKP易失活，须严格控制操作温度；3、充分匀浆以便较好地提取蛋白质；4、实验结果中A液比活性较低，分析原因可能是在操作不当导致蛋白质部分变性，故测得蛋白质含量较低，比活性也较低。