第三章沉淀反应技术

•1•第三章沉淀反应技术（Precipitationreactiontechnique）一、概述可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料浸出液、血清以及其他来源的蛋白质、多糖质、类脂体等）与其相应的抗体相遇后，在电解质参与下，抗原抗体结合形成白色絮状沉淀，出现白色沉淀线，此种现象称为沉淀反应。沉淀反应中的抗原叫沉淀原（precipitinogen）,与沉淀原发生反应的抗体称为沉淀素（precipitin）。沉淀反应的发生机制与凝集反应基本相同。不同之点是：沉淀原分子小，单位体积内总面积大，故在定量试验时，通常稀释抗原。沉淀反应主要包括有环状沉淀反应、絮状沉淀反应和琼脂扩散反应。环状沉淀反应是最早的沉淀反应，目前在链球菌的分类、鉴定，昆虫吸血性能及所吸血液来自何种动物的鉴别，肉品种属鉴定及炭疽尸体与皮张的检验工作中仍然应用。主要是用已知的抗体诊断未知的抗原。絮状沉淀反应是将抗原与血清在试管内混合，在电解质存在的情况下，抗原抗体复合物可形成混浊沉淀或絮状沉淀凝聚物，此法通常用于毒素与抗毒素的滴定。琼脂凝胶免疫扩散（Agar－gelimmunodiffusion）是沉淀反应的一种形式，是指抗原抗体在琼脂凝胶内扩散，特异性的抗原抗体相遇后，在凝胶内的电解质参与下发生沉淀，形成可见的沉淀线。这种反应简称琼脂扩散。抗原抗体扩散使用的凝胶种类很多，除琼脂外还有明胶、果胶、聚丙烯酰胺等，因此总的名称叫免疫扩散（Immunodiffusion简写为ID）。琼脂扩散是免疫扩散中的一种方法。琼脂扩散的原理是：物质自由运动形成扩散现象，扩散可以在各种介质中进行。我们所使用的1％～2%的琼脂凝胶，琼脂形成网状构架，空隙中是98％~99%的水，扩散就在此水中进行。1％~2%琼脂所形成的构架网孔较大，允许分子量在20万以下甚至更大些的大分子物质通过，绝大多数可溶性抗原和抗体的分子量在20万以•2•下，因此可以在琼脂凝胶中自由扩散，所受阻力甚小。二者在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处发生沉淀，此沉淀物因颗粒较大而不扩散，故形成沉淀带。一种抗原抗体系统只出现一条沉淀带，复合物抗原中的多种抗原抗体系统均可根据自己的浓度、扩散系数、最适比等因素形成自己的沉淀带。本法的主要优点是能将复合的抗原成分加以区分，根据沉淀带出现的数目、位置以及相邻二条沉淀带之间的融合、交叉、分枝等情况，就可了解该复合抗原的组成。二、环状沉淀反应以炭疽环状沉淀反应为例，此反应又称Ascoli氏反应。（一）材料与试剂1．已知炭疽沉淀血清，购买自生物制品所。2．待测炭疽沉淀抗原3．试管5mm×50mm、滴管4．0.3%石炭酸生理盐水（二）操作方法1．待测抗原的提取（1）取可疑为炭疽而死的病畜的实质脏器1g，放入试管或小三角烧瓶中，加生理盐水5ml～10ml，煮沸30min～40min，冷却后用滤纸过滤得清澈的液体，即为待测抗原。（2）如病料是皮张，可采用冷浸法。将样品高压灭活后，剪成小块并称重，加约5倍的0.5%生理盐水，室温浸泡18h～24小时，滤纸过滤，即为待检抗原。2．取试管5支（5mm×50mm）置于试管架上，编号。第1、2试管内加炭疽沉淀血清，第3、4试管内加正常血清，第5管内加待检抗原，分别用毛细滴管加至4mm～5mm。3．第1、4、5试管轻轻叠加等量缓冲液，第2、3试管轻轻叠加等量待检抗原。为防止上下两界面破坏，可将小试管从试管架取出，微倾斜，沿试管壁加入缓冲液或抗原。4．在试管架上静置数分钟，观察结果。（三）结果判定第2管内两液界面出现白色环状沉淀带，其余管无此种沉淀带判为阳性。•3•（四）注意事项1．反应物必须清澈，如不清澈，可离心，取上清液或冷藏后使脂类物质上浮，用吸管吸取底层的液体。2．必须进行对照观察，以免出现假阳性。3．采用环状沉淀反应，用以沉淀素效价滴定时，可将抗原做100×，1000×，2000×，4000×，8000×等稀释，分别叠加于抗血清上，以出现环状沉淀的最大稀释倍数，即为该血清的沉淀素效价。三、琼脂免疫扩散试验（一）材料与试剂1．琼脂粉2．平皿3．打孔器4．生理盐水或其他缓冲液，可加1/万的硫柳汞或叠氮钠防腐。（二）操作方法1．称取一定量的琼脂粉，按1%左右（0.8％～1.5%）的比例加入生理盐水或缓冲液，水浴煮沸融化20min。2．将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm～3mm。自然冷却。3．根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径）按模板打孔。也可直接用组合打孔器打孔。现在一般多打成梅花形孔图。4．挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。5．在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。6．以毛细滴管吸取样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。加少了，影响反应程度，加多了，易溢出，也影响反应结果。7．加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿盘中，37℃自由扩散24h～48h。（三）结果判定1．用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原；若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同，见图3-1。•4•图3-1琼脂免疫扩散试验结果示意图中间孔含A,B,C三种抗血清，a、b和a、c为不同型的抗原（呈双线或交叉），b、c为同一血清型的不同亚型（部分融合，有交叉）2．用做血清流行病学调查时，将标准抗原置中心孔，周围1、3、5孔加标准阳性血清，2、4、6孔分别加待检血清。待检孔与阳性孔出现的沉淀带完全融合者判为阳性。待检血清无沉淀带或所出现的沉淀带与阳性对照的沉淀带完全交叉者判为阴性。待检孔虽未出现沉淀带，但两阳性孔的沉淀带在接近待检孔时，两端均内向有所弯曲者判弱阳性。若仅一端有所弯曲，另一端仍为直线者，判为可疑，需重检。重检时，可加大检样的量。检样孔无沉淀带，但两侧阳性孔的沉淀带在接近检样孔时变得模糊、消失，可能为待检血清中抗体浓度过大，致使沉淀带溶解，可将样品稀释后重检。3．用以检测的抗血清的效价时，将抗原置中心孔，抗血清倍比稀释后置周围孔，以出现沉淀带的血清最高稀释倍数为该抗血清的琼扩效价。（四）注意事项1．不规则的沉淀线可能是加样过满溢出、孔型不规则、边缘开裂、孔底渗漏、孵育时没放水平、扩散时琼脂变干燥、温度过高蛋白质变性或未加防腐剂导致细菌污染等所致。2．抗原抗体的比例与沉淀带的位置、清晰度有关。如抗原过多，沉淀带向抗体孔偏移和增厚，反之亦然。可用不同稀释度的反应液试验后调节。ABCbcbabca321654•5•四、琼脂扩散试验诊断马传染性贫血病（一）材料与试剂1．精制琼脂粉2．打孔器、加样器、平皿3．标准阳性血清和标准阴性血清，由指定的生物制品厂购买。4．马传染性贫血病琼脂扩散用抗原，由指定的生物制品厂购买。5．pH7.4PBS液（二）操作方法1．取琼脂粉1g，加含有1/万硫柳汞的PBS液100ml，水浴加热使之完全融化。2．取平皿（直径9cm），将融化的琼脂倒入，每个平皿倒入15ml～18ml，使其厚度约为2.5mm，冷却后加盖，放入4℃～8℃冰箱内，至少4h。3．按7孔梅花图案打孔，中央孔一个，孔径4mm，外周孔6个，直径6mm，孔距8mm（中间孔至外周孔的中心距离），封底。4．中央孔加抗原，2、5号孔加标准阳性血清，其余1、3、4、6孔分别加被检血清，加满为止。加毕后，平皿加盖，平放入铺有数层湿纱布的带盖搪瓷盘内，置15℃～30℃条件下孵育。每日观察一次，连续3天。（三）结果判定当标准阳性血清孔与抗原之间出现一条明显致密的沉淀线时，再进行被检血清孔的判定。阳性：被检血清孔与抗原孔之间形成一条沉淀线，或者标准阳性血清的沉淀线末端向内弯向毗邻的被检血清孔。阴性：被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线，且标准血清阳性孔与抗原孔之间的沉淀线直向毗邻的被检血清孔。可疑：标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端似乎弯向毗邻被检血清孔，但不易判断。此种结果判为可疑。可疑结果必须进行复试，将抗原做2×，4×，6×，8×等倍数稀释，进行琼脂扩散，观察时间可延长至5d，最后判定结果。