第三章病毒和亚病毒内容提要病毒是专性寄生的大分子生物。病毒个体称病毒粒子,一般只有在电镜下才能看见,以“nm”度量。病毒粒子有各种形态,其典型代表分别为植物中的烟草花叶病毒(杆形)、动物中的腺病毒(20面体方形)和微生物中的E.coliT偶数噬菌体(蝌蚪形)。病毒粒子的主要成分为DNA或RNA和蛋白质壳体。有些病毒还有包膜包围。各类病毒的增殖过程大同小异。以T偶数噬菌体为例,可分为吸附、侵入、增殖、装配和裂解5个阶段。凡能侵入宿主细胞,在细胞内增殖引起细胞裂解的噬菌体称烈性噬菌体,反之则称温和性噬菌体。在染色体组上整合有温和噬菌体并能进行正常生长繁殖的宿主,称溶源菌,这种现象即为溶源性。定量描述烈性噬菌体增殖规律的曲线,称为一步生长曲线,其特征参数有潜伏期、裂解期和裂解量3个。动植物病毒与人类关系密切,对人类重要传染病的防治、工农业生产和环境保护等具有重大影响。亚病毒(类病毒、朊病毒、拟病毒)的发现刷新了生命体的最低极限,并对遗传信息流的中心法则提出了挑战,对阐明某些疑难病症的病因具有重要影响,是20世纪生命科学中的一件大事。病毒和亚病毒都是非细胞生物,它们的发现比细胞生物要迟得多,而且人类认识病毒和亚病毒往往是从它们的致病性开始的。1892年俄国学者伊万诺夫斯基(Ivanovski)首次发现烟草花叶病的感染因子能够通过细菌滤器,病叶汁液的滤过液能感染健康烟草发病。1898年荷兰生物学家贝依林克(M.W.Beijrinck)进一步验证了这个结果,并发现可以用酒精将烟草花叶病的致病因子从悬液中沉淀下来而不失去其感染力,而且能够在琼脂凝胶中扩散,但用培养细菌的方法却培养不出来。贝依林克给这种致病因子起名为“病毒(Virus)”,拉丁语的原意是“毒”。随后其他一些可通过细菌滤器的致病因子,包括植物的、动物的被陆续分离出来,人们便称之为“滤过性病毒(filterablevirus)”。到1931年,已知约有40种病是由病毒引起的,如麻疹、腮腺炎、天花、流感、水痘、脊髓灰质炎和狂犬病等。可是病毒的性质仍然是个谜。1935年美国生物学家斯坦莱(W.M.Stanley)从烟草花叶病病叶中提取出了病毒结晶,并证实该结晶具有致病力。这一事件成为分子生物学发展中的一个里程碑。斯坦莱也因此而荣获诺贝尔奖。随后鲍顿(FrederickCharlesBawden)和皮里(NormanW.Pirie)这两位英国生物化学家证明了病毒结晶含有核酸和蛋白质两种成分,而只有核酸具有感染和复制能力。20世纪30年代以后,由于电子显微镜技术和超速离心机的应用,不仅使人们看到了病毒的形象,而且对病毒的结构及化学组成也都有了更清楚的了解。人们将病毒定义为:超显微的、没有细胞结构的、由一种核酸(DNA或RNA)和蛋白质外壳构成的活细胞内的寄生物。它们在活细胞外以侵染性病毒粒子的形式存在,不能进行代谢和繁殖,一旦进入宿主细胞又具有生命特征。然而,1971年Diener发现了一种只含小分子量RNA而不含蛋白质的类病毒(viriods),说明自然界中存在着比病毒更简单的致病因子,这一发现对病毒的定义提出了挑战。1981年至1983年,又发现在四种多面体RNA病毒颗粒中伴随存在一种与类病毒相似的RNA分子,其复制和衣壳化都需要依赖于辅助病毒,被称为卫星病毒或拟病毒(virusiods)。1982年Prusiner发现引起羊瘙痒病的病原体是一种分子量约27kDa的蛋白质(不包含核酸)称为朊病毒(prions)。类病毒、拟病毒、朊病毒的发现,极大地丰富了病毒学的内容,使人们对病毒的本质又有了新的认识。病毒的定义随着分子病毒学的发展而不断更新。现在认为病毒是一种比较原始的、有生命特征的、能自我复制和专性细胞内寄生的非细胞生物。第一节病毒的形态结构一、病毒的形态与大小病毒的形态大小是病毒分类鉴定的标准之一。病毒一般呈球形或杆状,也有呈卵圆形、砖形、丝状和蝌蚪状等各种形态的。如腺病毒为球状,烟草花叶病毒为杆状。细菌病毒又称噬菌体,多为蝌蚪形,也有微球形和丝状的。大肠杆菌T偶数噬菌体为蝌蚪形,而大肠杆菌噬菌体fd为丝状,X174为球形。病毒个体微小,常以nm表示,其大小相差悬殊。较大的痘病毒直径约300nm,近似于最小的原核微生物(枝原体),如用姬姆萨、维多利亚蓝、荧光染料或镀银等方法染色处理后,在光学显微镜下可以观察到。而较小的口蹄疫病毒颗粒很小,直径约10~22nm。病毒能通过细菌过滤器,其大小大多在20~300nm范围内,超过了普通光学显微镜的分辨能力,必须用电子显微镜才能观察到。图3-1较形象地表示出病毒的形态和大小。图3-1几种病毒的形态和相对大小二、病毒的结构和化学组成及其功能病毒粒子(virion)是指一个结构和功能完整的病毒颗粒。病毒粒子主要由核酸和蛋白质组成。核酸位于病毒粒子的中心,构成了它的核心或基因组(genome),蛋白质包围在核心周围,构成了病毒粒子的壳体(capsid)。核酸和壳体合称为核壳体(nucleocapsid)(见图3-2)。最简单的病毒就是裸露的核壳体。病毒形状往往是由于组成外壳蛋白的亚单位种类不同而致。此外,某些病毒的核壳体外,还有一层囊膜(envelope)结构。图3-2病毒结构示意图(Madiganetal.,2000)1、核酸核酸组成各种病毒的核心。一种病毒只含有一种类型的核酸,DNA或RNA。核酸可以是单股的,也可能是双股的;可以是线状的,也可以是环状的。大多数病毒粒子中只含有一个核酸分子。少数RNA病毒含2个或2个以上的核酸分子,而且各个分子担负着不同的遗传功能,它们一起构成病毒的基因组,所以这些DNA病毒为双组分基因组、三组分基因组或多组分基因组。病毒核酸(基因组)储存着病毒的遗传信息,控制着其遗传变异、增殖和对宿主的感染性等。病毒核酸可借助理化方法加以分离,这种分离的核酸因缺乏壳体的保护,较为脆弱,但仍具有感染性,称为感染性核酸,其感染范围比完整的病毒粒子更广,但感染力较低。2、壳体是指围绕病毒核酸并与之紧密相连的蛋白质外壳,它由许多壳粒(capsomere)组成。壳粒是指在电子显微镜下可以辨认的组成壳体的亚单位,由一个或多个多肽分子组成。组成壳体的壳粒基本上有两种对称排列。一种是廿面体,壳粒沿着三根互相垂直的轴形成对称体,壳体一般为廿面体。腺病毒的衣壳就是一个典型的廿面体(图3-3)。另一种呈螺旋状,壳粒和核酸呈螺旋对称形排列成直杆状(如烟草花叶病毒)、伸长的纤维状(如噬菌体fd)、弯曲杆状(如马铃薯X病毒)。烟草花叶病毒是螺旋对称病毒中研究得最为详尽的一个例子,其病毒粒子呈杆状或线状,蛋白质壳体由壳粒一个紧挨一个地螺旋排列而成,病毒RNA位于壳体内侧螺旋沟中。病毒粒子全长300nm,直径15nm,由2130个壳粒组成130个螺旋。另外有些噬菌体同时具有两种对称性,称为复合性对称。有些病毒不具有任何对称性。病毒蛋白质的作用主要是构成病毒粒子外壳,保护病毒核酸;决定病毒感染的特异性,与易感染细胞表面存在的受体有特异亲和力;还具有抗原性,能刺激机体产生相应抗体。图3-3病毒外壳结构的对称性3、包膜(envelope)也称封套或囊膜。指包被在病毒核壳体外的一层包膜,主要成分为磷脂,此外还有糖脂、中性脂肪、脂肪酸、脂肪醛、胆固醇。囊膜一般为脂质双层膜,与这些膜相联的是病毒特异性蛋白。这些病毒特异性蛋白在病毒感染和复制过程中发挥作用。囊膜表面往往具有突起物,称刺突(spike)或包膜子粒(peplomer)。囊膜对一些脂溶剂如乙醚、氯仿和胆盐等敏感。有囊膜的病毒有利于其吸附寄主细胞,破坏宿主细胞表面受体,使病毒易于侵入细胞。三、宿主细胞的病毒包涵体宿主细胞被病毒感染后,常在细胞内形成一种光学显微镜下可见的小体,称为包涵体(图3-4)。包涵体多为圆形、卵圆形或不定形,性质上属于蛋白质。不同病毒在细胞中呈现的包涵体的大小、数目并不一样。大多数病毒在宿主细胞中形成的包涵体是由完整的病毒颗粒或尚未装配的亚单位聚集而成的小体,少数包涵体是宿主细胞对病毒感染的反应产物。一般包涵体中含有一个或多个病毒粒子,亦有不含病毒粒子的。病毒包涵体在细胞中的部位不一,有的见于细胞质中,有的位于细胞核中,也有的则在细胞核、细胞质内均有。由于不同病毒包涵体的大小、形态、组成以及在宿主细胞中的部位不同,故可用于病毒的快速鉴别,有的可作为某些病毒病的辅助诊断依据。有的包涵体还有特殊名称,如天花病毒包涵体叫顾氏(Guarnier)小体,狂犬病毒包涵体叫内基氏(Negri)小体,烟草花叶病毒包涵体被称为X体。包涵体可以从细胞中移出,再接种到其他细胞时仍可引起感染。图3·4病毒在一些宿主细胞中产生的包涵体A.天花病毒在家兔角膜细胞质中产生的顾氏小体;B.狂犬病毒在犬脑神经细胞质中的内基氏小体;C.家兔角膜接种疱疹病毒后,上皮细胞核内的包涵体。第二节病毒的分类病毒分类最初是根据病毒的寄主特性将病毒分为动物病毒、植物病毒和细菌病毒(噬菌体)三大类,这种分类方法有其实用性,而沿用至今。但这种分类方法并没有反映出病毒的本质特征。随着电镜技术的发展以及分离、提纯病毒新方法的应用,逐渐转向病毒本身的结构特征、化学组成的研究、使病毒的分类朝着自然系统的方向发展。病毒分类的依据有:①基因组性质与结构;②衣壳对称性;③有无包膜;④病毒粒子的大小、形状;⑤对理化因素的敏感性;⑥病毒脂类、碳水化合物、结构蛋白和非结构蛋白的特征;⑦抗原性;⑧生物学特性(繁殖方式、宿主范围、传播途径和致病性)。国际病毒分类系统采用目、科、属、种的分类单元,但是亚病毒感染因子采用任意分类。目的后缀为“virales”、科的名字后缀为“viridae”、亚科缀“virrinae”、属以下缀“Virus”。国际病毒分类委员会(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,简称ICTV)在2001年公布的病毒分类和命名第七次报告中病毒分类系统设立了3个病毒目、66个病毒科(包括2个类病毒科)、9个病毒亚科和244个病毒属(包括32个暂定属和7个类病毒属)。教学内容第三节噬菌体1915年英国人陶尔德(Twort)在培养葡萄球菌时,发现菌落上出现透明斑。用接种针接触透明斑后,再向另一菌落上接触,不久接触的部分又出现透明斑。1917年在法国巴黎巴斯德研究所工作的加拿大籍微生物学家第赫兰尔(d′Herelle)也观察到痢疾杆菌的新鲜液体培养物能被加入的某种污水的无细菌滤液所溶解,混浊的培养物变清。若将此澄清液再行过滤,并加到另一敏感菌株的新鲜培养物中,结果同样变清。以上现象被称为陶尔德—第赫兰尔(Twort—d'Herelle)现象。第赫兰尔将该溶菌因子命名为噬菌体(bacteriophage,phage)。噬菌体具有病毒的一般特性,是原核微生物的病毒,包括噬细菌体(bacteriophage)、噬放线菌体(actinophage)和噬蓝细菌体(cyanophage)。一、噬菌体的形态结构在电子显微镜下观察噬菌体有三种基本形态:蝌蚪形、微球形和丝状,从结构来看又可分为六种不同的类型,见图3-5。图3-5噬菌体的基本形态和大小图中所列的T-系噬菌体是目前研究得最广泛而又较深入的细菌噬菌体,并对它们进行了从T1-T7的编号,这类噬菌体呈蝌蚪形。大肠杆菌T4噬菌体为典型的蝌蚪形噬菌体,由头部和尾部组成。头部为由蛋白质壳体组成的廿面体,内含DNA。尾部则由不同于头部的蛋白质组成,其外包围有可收缩的尾鞘,中间为一空髓,即尾髓。有的噬菌体的尾部还有颈环、尾丝、基板和尾刺(图3·6)。图3·6大肠杆菌(E.coli)噬菌体结构(引自Prescottetal.,2002)和电镜照片图3·7噬菌体T4吸附在大肠杆菌细胞(Madiganetal.,1997)A.未吸附B.C.尾部附着D.尾鞘收缩,注入DNA二、烈性噬菌体的增殖周期根据噬菌体与宿主细胞的关系可分为烈性噬菌体(virulentphage)和温和性噬菌体(temperatephage)。凡侵入细胞后,进行营养繁殖,导致细胞裂解的噬菌体称烈性噬菌