第三章菌液预处理

1/6第三章发酵液的预处理和细胞的分离固液的分离方法过滤法：适用于大规模的生化分离过程处理量大、成本低；离心分离法：对于固体颗粒小、溶液黏度大的发酵液和细胞培养液，用过滤的方法很难实现固液分离，必须采用离心操作，但费用较高。生物料液在利用传统的过滤分离时存在的问题过滤的速度极其缓慢，以致生产难以进行。必须了解生物料液的特性，设法改善生物料液的性能，使过滤顺利进行。细胞悬浮液的基本特性细胞悬浮液：包含生物细胞、水、细胞代谢物、未消耗的培养基以及少量的细胞碎片。细胞悬浮液能否实现理想的分离效果取决于细胞的种类及表面特性、分泌物的性能等，因为这些特性决定了细胞在发酵液中的状态、即是自由状态还是絮凝状态以及悬浮液的黏度等。发酵液的黏度、细胞的大小、状态决定了固-液分离采用的方式、设备。工业生物技术中微生物的大小在细胞回收中细胞和聚集物重要性质悬浮液分离时存在的问题：（1）细胞和培养液密度相近，难以采用离心、沉降法处理；（2）细胞具有可压缩性，悬浮液黏度高导致过滤阻力大、滤布容易堵塞；（3）植物、动物细胞耐受剪切力的程度低于微生物细胞，在采用错流过滤的时候要注意。为了降低发酵液的黏度、增大细胞聚集度及降低其亲水性，降低分离的难度和成本，对细胞悬浮液进行预处理必要的。悬浮液的预处理方法（1）加热法。适用于热稳定性的目标产物（2）调节溶液的pH值。主要是增加细胞的聚集程度，一般用无机酸或碱来调节这两种方法都能使液体黏度降低，过滤速度加快。如生产链霉素的悬浮液预处理时，调pH3.0左右，加热至70°C，维持半小时以凝固蛋白质，这样可使悬浮液黏度降低至最初的1/6，过滤速度增大10-100倍。（3）加入凝聚剂和絮凝剂2/6凝聚和絮凝在预处理中常用于细胞、菌体（胞外产物）、细胞碎片（胞内产物）以及蛋白质等胶体粒子的去除。凝聚剂：铝、铁的盐类或石灰石等可水解的无机盐类电解质。作用机理：利用带电分子对细胞表面电荷的中和，消除双电荷层而脱稳，或是通过形成氢键等方式与细胞作用产生凝聚，主要目的是降低细胞表面与水的相互作用。双电层：细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面都带有电荷，带电的原因很多，主要是自身基团的电离或吸附溶液中的离子。通常发酵液中的细胞或菌体带负电荷，由于静电引力的作用将溶液中带相反电性的离子吸附在周围，在粒子和溶液的界面上形成双电层。ε电位能够实际测得，认为是控制胶体间电排斥作用的电位，用来表征双电层的特征。胶体保持分散的两个原因：1、双电层的排斥作用2、胶体周围存在的水化层这两个原因都阻碍离子间的直接聚集。如果在发酵液中加入具有相反电荷的电解质，就能中和胶体的电性，使?电位迅速降低，当双电层的排斥力不足以抗衡胶体间的范德华引力时，胶体间就会产生相互聚集作用；同时，电解质离子在水中的水化作用会破坏胶粒周围的水化层，、有利于其聚集。反离子的化合价越高，凝聚能力越强。阳离子对带负电的胶粒凝聚能力的次序为：Al3+?Fe3+?H+?Ca2+?Mg2+?K+?Na+?Li+常用的凝聚剂有：Al2(SO4)3·18H2O（明矾）；AlCl3·6H2O；FeCl3;ZnSO4;MgCO3等絮凝作用：利用含有多个功能基团的线状高分子聚合物的架桥作用使细胞发生絮凝而变成粗大的絮凝团。絮凝剂的浓度、悬浮液的酸度和离子强度都将影响絮凝的效果。絮凝剂：高分子的聚合物，必须长链线状的结构，易溶于水，其相对分子量可高达数万至一千万以上。天然：多聚糖类，如壳聚糖、海藻酸钠、明胶等；合成高聚物：分为阴离子、阳离子和非离子三大类。如聚丙烯酰胺、聚乙烯酸钠、聚二烯丙基四胺盐等。无机：聚合铝盐和聚合铁盐等。阳离子絮凝剂同时具有凝聚和产生吸附架桥的双重机理，而非离子型和阴离子型絮凝剂主要通过分子间引力和氢键等作用产生吸附架桥，常与无机电解质凝聚剂搭配使用。过滤法是化工过程中的传统操作，是目前生化分离中用于分离细胞和发酵液的主要方法。达西（Darcy)定律：K------Darcy定律的渗透度假设滤饼为球形的多孔床层，则科泽尼（Kozeny）方程为使用惰性助滤剂改善过滤效果助滤剂：颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物质。如硅藻土（水生植物的遗骸）、膨胀珍珠岩（火山岩）、石棉、炉渣等；作用机理：增加滤饼的孔隙率、减小其不可压缩性，降低过滤阻力，增加流速、降低成本。使用方法：（1）在滤布上预涂一层助滤剂，待滤毕后与滤饼一起除去；（2）助滤剂按一定比例混入悬浮液中，降低其可压缩性；滤器的类型:在生物工艺中应用较广并具有工业意义的过滤器主要有真空、压力过滤器两大类。（1）真空过滤器a)转鼓真空过滤器是用于大规模生物分离的主要过滤设备，可以分离较难过滤悬浮固体粒子。能实现自动操作，故劳动强度小。问题：助滤剂消耗大，不能连续操作，仅限于低黏度的滤液使用。lpKU)(FFlRlRpUcc)(2FVVWpAAUdtdV32)1(''sSK3/6b）圆盘真空过滤器1.水平圆盘过滤器：适用于对滤饼洗涤效果要求较高的场合。2.水平回转翻盘式真空式过滤器：适用于过滤密度大、浓度高的粗颗粒悬浮液。与转鼓过滤器相比，圆盘直径大，更易实现大型化。其最大过滤面积可达400m2离心法分为两种形式：离心沉降：利用固-液两相的相对密度差，在离心机无孔转鼓或管子中进行悬浮液的分离操作。离心过滤：利用离心力并通过过滤介质，在有孔转鼓离心机中分离悬浮液的分离操作。优点：使用方便，可以实现对颗粒小或黏度大悬浮液的分离。缺点：大规模使用价格昂贵。离心沉降：1、原理：悬浮液中的大多数细菌都可看成是直径为d的球形粒子,根据Stocks定律,其中CD为阻滞系数，A为粒子在运动方向上的投影面积，u为运动速度。CD的数值取决于雷诺数Re的变化。对于球形粒子，Re1，CD=24/Re，对于生化溶质，可以满足Re?1的要求，所以当粒子匀速沉降时，Fg=Ff，故匀速沉降速率为gdus)(182如果粒子在离心场中沉降，则重力加速度g换成离心加速度ω2r，即：S为沉降系数，蛋白质的相对分子量越大，沉降系数越大。Fc------离心力或离心加速度Z-----分离因素或离心强度在科学文献中，常用离心力或离心加速度来表征离心的操作条件离心方法差速离心法：一般用于细胞匀浆中细胞器的分离，需要反复离心、洗涤。区带离心：只适用于有一定沉降系数差的粒子，与粒子的密度无关。如核酸混合物的分离，常用蔗糖作为液体梯度的溶质。离心设备Z越大，越有利于分离。常按分离因素Z的大小，对离心机进行分类。（1）Z3000，为常速离心机（2）Z=3000~5000，为中速离心机（3）Z50000，为高速离心机（4）Z=2*104~106，为超高速离心机离心沉降设备瓶式离心机：实验室常用的离心机，低、中速；工业用无孔转鼓离心机（1）管式离心机：直径为40-150mm，长径比为4~8，离心强度可达15000~65000，处理能力为0.1~0.4m3/h,适合分离的固体粒子直径为0.01~100µm,固液密度差大于0.01g/cm3,体积浓度小于1%的难分离悬浮液，常用于微生物菌体和蛋白质的分离。（2）碟片式离心机：这是一种应用最为广泛的离心机。碟片式离心机的特点：密闭转鼓内装有十至上百个锥顶角为60°-100°的碟片，碟片的间隙一般只有0.5~2.5mm,固体颗粒的沉降距离极短，分离速度快、效果好。这类离心机的离心强度可达3000~10000。根据卸渣的方式又可分为：A、人工排渣碟片离心机：适用于固相浓度低的场合（1%-2%）B、喷嘴排渣碟片离心机：转鼓周围有2-24个喷嘴，排渣的含液量高，适用于浓缩过程，浓缩比可达5~20，最大处理量为300m3/h,适合分离的固体粒子为为0.1~100µm,固液浓度小于25%的悬浮液。C、活门排渣碟片离心机：可连续排渣，不须停车。最大处理量为40m3/h,适合分离的固体粒子为为0.1~500µm,固液密度差大于0.01g/cm3,固液浓度小于15%的悬浮液,对一些难分离物质特别有效，因此应用范围是最广的。如大肠杆菌的分离等。离心过滤原理：是以离心力为推动力的过滤过程。兼有离心和过滤的双重任务。gdgVFssg](6[)(32213uACudFDfduRe)4)(21(Re24)4)(21(2222duduCFDf222)18Srωrρ)ωρ(ρμdusrNrFc2224grNZ2244/6第三章（2）细胞破碎（celldisruption)细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜,使目标产物释放出来。其中，细胞壁的破碎最为关键。在细胞破碎之前，要充分了解细胞的类型、细胞壁的结构以及目标产物的性质和存在的部位。只有这样才能选择合适的破碎方法，达到以下两个目的：1使目标产物最大量地释放到液相中；2尽可能减少杂质的量，以利于后续分离操作细胞壁和细胞膜的组成和结构：革兰氏阴性菌细胞壁结构、革兰氏阳性菌的细胞壁结构细胞壁的刚性、强度和保护细胞的作用主要来自其构成的主要成分肽聚糖。肽聚糖是N-乙酰胞壁酸和带有D-型或L-型氨基酸侧链的N-乙酰胞壁酸的多聚体。是高度交联的分子。细胞破碎和产物释放原理几种常用的细胞破碎方法1．高压匀浆法高压匀浆法(High—pressureHomogenization)所用设备是高压匀浆机，它由高压泵和匀浆阀组成，高压泵提供物料连续流动的动力，破碎主要在匀浆阀处完成。高压匀浆的结构简示1-细胞悬浮液；2-加工后的细胞匀浆；3-阀座；4-碰撞环；5-阀杆破碎机理从高压室(几百个大气压)压出的细胞悬浮液(见图)经过阀座的中心孔道从阀座和阀杆之间的小环隙中喷出，速度可达几百米每秒。这种高速喷出的浆液又射到静止哗击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列过程中经历了高速造成的剪切、碰撞以及由高压到常压的变化，从而造成细胞的破碎。破碎动力学动力学方程：R是单位生物量释放出的内含物量(mg／g)，Rm是R的最大值；K为破碎速度常数，表示破碎的阻力；动力项P也可以表示成动能项：式中S为破碎率，其定义为S=R/Rmax，?为悬浮液的密度；?为射流的速度(压力为15MPa时，流速高达190m/s)。影响因素机械因素：阀与阀座的形状、二者之间的距离操作因素：操作压力P和循环次数N，一般说来，增加压力或增加破碎次数都可以提高破碎率，但当压力增加到一定程度后对匀浆阀的磨损较大。细胞：1.细胞壁的机械强度：微生物的形态和生理状态决定了细胞的机械强度。破碎参数(Rm、K、?、b、P等)随微生物种类和培养条件的不同而有所差异。2.目标产物在胞内的位置：胞内物质的释放快慢则由内含物在胞内的位置决定。例如，胞间质的释出先于胞内质，而膜结合酶最难释放。式中S为破碎率，其定义为S=R/Rmax，?为悬浮液的密度；?为射流的速度(压力为15MPa时，流速高达190m/s)。微生物的形态（morphology)和生理状态(physiology)决定了细胞的机械强度，因此上述破碎参数(Rm、K、?、b、P等)随微生物种类和培养条件的不同而有所差异。例如指数?因微生物而异:温控与能耗人们普遍关心的是活性物质在破碎过程中的失活问题。研究表明蛋白质和酶的失活主要由匀浆过程中产生的热引起。如果能将温度控制在35℃以下，那么酶活损失可以忽略。对于温度敏感性物质，低温操作是必需的。高压匀浆一般需多级操作，每次循环前往往进行级间冷却。尽管提高压力有利于细胞破碎，但是提高压力需增加能耗(3.5kW／100MPa)，同时为移走产生的热量(23.8℃／100MPa)需要付出代价。机械破碎的能耗主要包括提供动力(如压力)消耗的能量以及低温操作耗费的能量。适用范围除较易造成堵塞的团状或丝状真菌、较小的革兰氏阳性菌以及质地坚硬的亚细胞器(如包含体，inclusionbody)不适于用高压匀浆器处理以外，其它微生物细胞都可以用高压匀浆法破碎。高速珠磨法高速珠磨法(High—speedbeadmill)也是一种有效的细胞破碎方法。珠磨机是