第三章血栓与止血一般检验

第三章血栓与止血一般检验实验一血小板计数【目的】掌握血小板(platelet)的显微镜目视计数方法。【原理】血液经稀释液按一定比例稀释和破坏红细胞后，滴入血细胞计数板内，在显微镜下计数一定范围内的血小板数量，经过换算求出每升血液中血小板的数量。【器材】1．试管、试管架。2．吸管、吸耳球。3．微量吸管、胶吸头、干脱脂棉。4．玻棒。5．改良Neubauer计数板、盖玻片、绸布。【试剂】10g/L草酸铵稀释液：草酸铵10g，EDTA-Na20.12g溶于1000ml蒸馏水中，混匀。【标本】EDTA-K2抗凝静脉血或末梢血。【操作】1．吸取稀释液准确吸取10g/L草酸铵稀释液0.38ml，置于清洁小试管中。2．采血及加血常规消毒无名指，穿刺后，让血液自然流出，准确采血20μL，置于含有草酸铵的稀释液中，立即充分混匀。3．稀释待完全溶血后再混匀1min。4．充液静置取混匀的血小板悬液1滴充入计数池内，静置10～15min，使血小板充分下沉。空气干燥季节应将血细胞计数板置湿盒内。5．计数用高倍镜计数中央大方格的四角和中央共5个中方格内血小板数量。6．计算血小板数/L＝N×5×10×20×106=N×109N：表示5个中方格内数得的血小板数。×5：将5个中方格血小板数换算成1个大方格血小板数。×10：将1个大方格血小板数换算成1μl血液内血小板数。×20：血液的稀释倍数。×106：由1μl换算成1L。7．报告方式XX×109/L。8．操作示意见图2-1。【参考值】（100～300）×109/L。【注意事项】1．稀释液的要求定期检查稀释液的质量，检测前应先作稀释液空白计数，计数值为零时方可充液计数。草酸铵稀释液要清洁，无细菌、尘埃等污染。存放时间较长后应过滤后再使用。2．采血毛细血管采血时，针刺应达3mm深，使血液流畅。拭去第1滴血后立即采血，以防血小板聚集和破坏。如果同时做白细胞和血小板计数时，应先采血做血小板计数。3．制备悬液血液加入血小板稀释液内要充分混匀，必须轻轻摇动标本2min或200次以上，但不可过度振荡，以免导致血小板破坏、聚集或有气泡，引起计数误差。4．充池血小板悬液充入计数池内需要静置10～15min，使血小板完全下沉后再计数。但应注意保持湿度，避免水分蒸发而影响计数结果。血小板如成簇分布，应重新采血复查。溶血欠佳时，应更换稀释液或用200倍稀释法计数整个中间大方格内的全部血小板数，最后计算出每升血液中的血小板数量。5．计数的光线要求计数时光线不可太强，注意微有折光性的血小板与尘埃等的鉴别，附着在血细胞旁的血小板也要注意，不要漏数。6．计数①如果血小板悬液充入计数池后时间较长，血小板会失去光泽而不易辨认，因此应掌握好计数时间，应在1h内计数完毕，否则结果偏低。②每份标本最好计数2次，若计数之差在10%以内，取其均值报告。若计数之差大于10%，应作第3次计数，取2次相近结果的均值报告。7．器材与试剂所用计量器材必须标准化。草酸铵质量必须是AR级或GR级，若用CP级溶血效果差。8．药物影响检查前患者应避免服用含有阿司匹林及其他抗血小板药物。（刘成玉）实验二凝血酶原时间测定一、试管法【目的】掌握凝血酶原时间(prothrombintime,PT)测定的试管法。【原理】PT是在体外满足外源性凝血全部条件后的血浆凝固所需的时间。在抗凝血浆中加入过量的组织凝血活酶和Ca2+，使凝血酶原转化为凝血酶，后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。测定从加入Ca2+到血浆开始凝固所需时间，即为PT。【器材】1.1.水浴箱。2.2.试管、试管架。3.3.吸样枪、吸头。4.4.离心机。5.5.秒表。【试剂】1．25mmol/L氯化钙凝血活酶试剂(商品试剂)按说明书要求加一定量蒸馏水溶解、混匀后使用，试剂必须注明国际敏感指数(internationalsensitivityindex，ISI)。2．正常参比血浆（商品试剂）用20个以上男女各半正常人血液经109mmol/L枸橼酸钠抗凝(血液与抗凝剂之比为9：1)。以3000r/min离心10min，分离血浆后，混合分装为每瓶1ml，冻干保存。【标本】109mmol/L枸橼酸钠抗凝的静脉血(血液与抗凝剂之比为9：1)。【操作】1．分离乏血小板血浆将标本以3000r/min离心10min，分离血浆。2．平衡温度将冻干保存的正常参比血浆和氯化钙组织凝血活酶溶液置室温中15min。3．温浴将正常参比血浆、待检血浆和氯化钙凝血活酶溶液置37℃水浴中温浴5min。4．测定正常参比血浆的PT(1)(1)启动计时：取小试管1支，加入正常人参比血浆0.1ml，37℃水浴预温30s，再加入经预温的氯化钙组织凝血活酶溶液0.2ml，立即混匀并启动秒表。(2)(2)终止计时：不断轻轻倾斜试管，记录至液体停止流动所需要的时间。(3)(3)重复步骤（1）、（2）测定2～3次，取平均值，即为PT值。5．测定待检血浆的PT取待检的乏血小板血浆参照步骤4的操作方法测定其PT值。6．报告方式①以直接测定的时间（PT）报告，同时，报告正常参比血浆PT。②以PT比值(prothrombinratio，PTR)报告：PTR=待检血浆PT/正常参比血浆PT。③以国际标准化比值(internationalnormalizedratio,INR)报告：INR=PTRISI。7．操作示意见图3-1。图3-1凝血酶原时间测定操作示意图【参考值】每个实验室应建立所用测定方法相应的参考值。通常：①PT：成人11～13s，新生儿延长2～3s，早产儿延长3～5s（3～4d后达到成人水平）；待检者的测定值较正常对照值延长超过3s以上有临床意义。②PTR：0.85～1.15。③INR：0.85～1.5；口服抗凝剂治疗不同的疾病需不同的INR，临床常将INR2～4作为口服抗凝剂治疗的适用范围。【注意事项】1．试剂由于不同来源、不同制备方法的组织凝血活酶对结果影响很大，造成结果的可比性差，特别影响判断口服抗凝剂的治疗效果。世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)提出以人脑凝血活酶67/40批号作为标准品，并以ISI表示各种制剂与67/40之间的相互关系。67/40为原始参考品，定67/40的ISI为1.0。市场上供应的组织凝血活酶试剂应注明ISI值，选用ISI2.0的组织凝血活酶为宜。2．标本(1)(1)应使用对凝血因子无激活作用的塑料制品或硅化的玻璃器械收集标本，如硅化试管、硅化注射器等。所用试管必须洁净、干燥、无划痕。(2)(2)采血要顺利，否则可激活凝血因子。静脉压迫时间过长可引起局部纤溶活化。(3)(3)采血后应仔细检查标本有无溶血、黄疸、脂血和血凝块，任何微小的凝块都会影响测定结果，必须重新采血。溶血的血浆可导致凝血时间假性缩短。部分凝血可导致凝血时间假性延长。(4)(4)血液与抗凝剂要充分混匀。血液与抗凝剂比例(9:1)要准确。枸椽酸盐比例过高或过低，都会影响PT测定结果的准确性。(5)(5)采血后宜在1h内完成测定。血浆在4℃保存不应超过4h，-20℃可保存14d，-70℃可保存6个月。(6)(6)血细胞比容（Hct）小于0.2或大于0.5时，应按下式调整抗凝剂的用量：抗凝剂(m1)=（100－Hct）×血液(m1)×0.00185。(7)(7)由于每次使用的氯化钙凝血活酶活性不尽相同，测定的条件也略有变动，故每次测定均需有正常对照。(8)分离血浆时离心条件要确保。以3000r/min离心10min，以获得乏血小板的血浆；如果血浆中富含血小板，可导致凝血时间假性缩短。3．温浴水浴温度要控制在(37.00.5)℃，温度过高或过低都可影响测定结果。温度过高，凝血时间缩短；温度过低，凝血时间延长。4．测定(1)(1)检测方法要规范化，尽量采用国际血栓和止血委员会（InternationalCommitteeonThrombosisandHaemostasis，ICTH）及国际血液学标准化委员会（InternationalCouncilforStandardizationinHaematology，ICSH）公布的参考方法。(2)(2)先测定正常参比血浆的凝血酶原时间，结果在正常允许范围内才测定待检者血浆。(3)(3)所有标本均做2～3次测定，结果相差应小于5％。若2个结果相差大于5％，再做1次单份或双份测定，取相近2个结果的均值报告。5．报告方式目前PT报告方式有PT、PTR和INR。前两者存在的偏差较大，对临床上指导口服抗凝药物冶疗用量有一定危险性，且难以开展室间质量评价。因此在报告PT、PTR的同时，为了标准此类待检者凝血功能的表述，应按ICTH及ICSH的建议报告INR。影响INR的因素较多，主要有：①ISI：ISI值越大，试剂的敏感性就越低，PTR换算成INR值的误差也就越大；②试剂对凝血因子缺乏的反应性的差异；③不同凝血活酶测得PTR的精确性不同。二、血凝仪法【目的】掌握凝血酶原时间的血凝仪测定法。【原理】同试管法。【器材】1．血凝仪。2．其余同试管法。【试剂】同试管法。【标本】同试管法。【操作】1．分离乏血小板血浆同试管法。2．平衡温度同试管法。3．预温同试管法。4．测定正常参比血浆的PT按血凝仪的操作方法将正常人参比血浆0.1ml，与氯化钙组织凝血活酶试剂0.2ml混匀，血凝仪自动测定血浆凝固的终点，并显示正常人混合血浆的PT值。5．测定待测血浆以同样方法测定待测血浆的凝固时间。6．报告方式同试管法。【参考值】同试管法。【注意事项】1．规范操作为了确保试验的准确性，必须应用仪器配套供应的试剂，并且严格按照操作规程操作。2．血凝仪（1）PT的仪器法测定由半自动或全自动血凝仪完成，全自动血凝仪的准确性和精密度高。不同仪器及试剂测定同一血浆，其PT也有一定差异，但INR应一致。（2）血凝仪的检测原理也不尽相同。常用的有比浊法、黏度法。比浊法是通过血浆凝固前后光散射的变化来检测血浆的凝固时间。脂血、黄疸、溶血等标本影响测定，但黏度法克服了这一缺点。黏度法是通过感受检测体系内磁珠的振幅变化来检测试验终点。3．其他同试管法。实验三活化部分凝血活酶时间测定一、试管法【目的】掌握活化部分凝血活酶时间(activatedpartialthromboplastintime,APTT)测定的试管法。【原理】APPT是在体外满足内源性凝血全部条件后的血浆凝固所需的时间。在37℃条件下，以白陶土（激活剂）激活因子Ⅻ，以脑磷脂（部分凝血活酶）代替血小板提供凝血的催化表面，再加入适量的Ca2+即可满足内源性凝血的全部条件。测定从加入Ca2+到血浆凝固所需的时间即为APTT。【器材】同凝血酶原时间测定。【试剂】1．APTT试剂含激活剂白陶土、硅藻土或鞣花酸及部分凝血活酶脑磷脂，液体试剂混匀后可直接使用，冻干试剂需用蒸馏水溶解再使用。2．25mmol/L氯化钙溶液无水氯化钙2.7747g溶于1000ml蒸馏水。3．正常参比血浆（商品试剂）。【标本】同凝血酶原时间测定。【操作】1．1．分离乏血小板血浆同血浆凝血酶原时间测定。2．2．平衡温度用蒸馏水溶解正常人参比血浆，于室温下静置15min以上，充分混匀。3．温浴氯化钙溶液将25mmol/L氯化钙溶液于37℃水浴中温浴3min。4．测定正常人参比血浆的APTT(1)(1)温浴活化：试管中加入正常人参比血浆和APTT试剂各0.1ml，混匀，37℃水浴中温浴3min，期间轻轻振摇数次。(2)(2)加Ca2+计时：试管中加入温浴至37℃的25mmol/L氯化钙溶液0.1ml，立即混匀并开始计时，并置水浴中不断振摇。约30s时，不时地缓慢倾斜试管，观察试管内液体的流动状态，当液体停止流动时停止计时，记录时间(秒)。(3)(3)重复步骤（1）、（2）测定2～3次，取其平均值。5．测定待检血浆的APTT取待检血浆参照步骤4的操作方法测定其APTT值。6．报告方式待检血浆APTT：XXs;正常人参比血浆APTT：XXs。7．操作示意见图3-2。图3-2活化部分凝血活酶时间测定操作示意图【参考值】每个实验室