第三章高效液相色谱分析

龙岩学院分析化学精品课程电子课件1第三章高效液相色谱分析基本要点：1.了解高效液相色谱法的优点及适用范围；2.了解高效液相色谱仪的主要部件及高效液相色谱法基本流程；3.理解常用检测器的原理、适用的分析对象及适用范围；4.理解各种分离方式的原理及选择原则。第一节高效液相色谱法的特点一、概述液相色谱法是指流动相为液体的技术。早期的液相色谱（经典液相色谱）是将小体积的试液注入色谱柱上部，然后用洗脱液（流动相）洗脱。这种经典色谱法，流动相依靠自身的重力穿过色谱柱，柱效差(固定相颗粒不能太小)，分离时间很长。70年代初期发展起来的高效液相色谱法，克服了经典液相色谱法柱效低，分离时间很长的缺点。成为一种高效、快速的分离技术。高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。二、特点1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。2.高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h。3.高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条龙岩学院分析化学精品课程电子课件2件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75%～80%）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。第二节影响色谱峰扩展及色谱分离的因素一、液相色谱速率理论—影响色谱峰扩展因素1.涡流扩散项HeA=2λdp其含义与其相色谱法相同。2．纵向扩散项HdHd=CdDm/u(注：对GC:B/u=2γDg/u)式中Cd为常数。由于分子在液相中扩散系数比气相中要小得多，一般小4~5个数量级。故在液相色谱中，此项可以忽略不计。3．传质阻力项可分为固定相传质阻力项Hs和流动相传质阻力项。a.固定相传质阻力项HsHs=CsDf2u/Ds式中：Cs为与k有关的常数，Df固定液的液膜厚度，Ds试样分子在固定液中的扩散系数。它与气相色谱法中传质阻力项的含义相同。b.流动相传质阻力项：i.流动的流动相传质阻力项Hm：当试样分子随流动相进入色谱柱时，靠近固定相颗粒的分子流速较慢一些，中央的分子流速较快一些，从而引起色谱峰型扩张。Hm=Cmdp2u/Dm式中：Cm为与k有关的函数，dp固定相颗粒直径，Dm组分在流动性中的扩散系数。ii.流动相传质阻力项Hsm：由于固定相是多孔的，部分流动相分子可能进入固定相的微孔中而滞留固定相中的某一局部，滞留在固定相微孔中这部分流动相一般是停滞不流动的。流动相中的试样分子要与固定相进行质量交换，必须先自流动相扩散到滞留区。因此，固定相的颗粒体积越大，微孔越深，传质速度越慢，峰型扩张越严重。龙岩学院分析化学精品课程电子课件3Hs=Csmdpu/Dm式中：Csm为一常数，dp固定相颗粒直径，Dm组分在流动性中的扩散系数。要降低Hsm，应采用颗粒小，微孔浅，孔径大的固定相。综上所述，柱内各种因素引起的塔板高度H为：H=2λdp+CdDm/u+(CsDf2/Ds+Cmdp2/Dm+Csmdp/Dm)可简写为：H=A+B/u+Cu上式与气相色谱的速率方程在形式上是一致的，其主要区别在于纵向扩散相可以忽略不计。提高柱效的途径：减小填料粒度以加快传质速率；提高柱内填料装填的均匀性。二、影响分离的因素——流速由图3-1知，液相色谱H-u曲线与其气相色谱不同，是一段斜率不大的直线，只是因为分子扩散相对H值的影响可以忽略不计。在液相色谱中，使用较高流速，柱效不会明显下降，有利于实现快速分离。第三节高效液相色谱法的主要类型及其分离原理根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：1．液—液分配色谱法(Liquid-liquidPartitionChromatography)及化学键合相色谱(ChemicallyBondedPhaseChromatography)流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度；Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K龙岩学院分析化学精品课程电子课件4大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。a.正相液—液分配色谱法(NormalPhaseliquidChromatography):流动相的极性小于固定液的极性。b.反相液—液分配色谱法(ReversePhaseliquidChromatography):流动相的极性大于固定液的极性。c.液—液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。2．液—固色谱法流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子(X)和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm+nSa======Xa+nSm式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。当吸附竞争反应达平衡时：K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。]3．离子交换色谱法(Ion-exchangeChromatography)IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下：X-(溶剂中)+(树脂-R4N+Cl-)===(树脂-R4N+X-)+Cl-(溶剂中)当交换达平衡时：KX=[-R4N+X-][Cl-]/[-R4N+Cl-][X-]分配系数为：DX=[-R4N+X-]/[X-]=KX[-R4N+Cl-]/[Cl-][讨论：DX与保留值的关系]凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。4．离子对色谱法(IonPairChromatography)离子对色谱法是将一种(或多种)与溶质分子电荷相反的离子(称为对离子或反离子)加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示：X+水相+Y-水相===X+Y-有机相龙岩学院分析化学精品课程电子课件5式中：X+水相--流动相中待分离的有机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X+Y---形成的离子对化合物。当达平衡时：KXY=[X+Y-]有机相/[X+]水相[Y-]水相根据定义，分配系数为：DX=[X+Y-]有机相/[X+]水相=KXY[Y-]水相[讨论：DX与保留值的关系]离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。5．离子色谱法(IonChromatography)用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。以阴离子交换树脂（R-OH）作固定相，分离阴离子（如Br-）为例。当待测阴离子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时，发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应的逆过程）：抑制柱上发生的反应：R-H++Na+OH-===R-Na++H2OR-H++Na+Br-===R-Na++H+Br-可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸H+Br-，可用电导法灵敏的检测。离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。龙岩学院分析化学精品课程电子课件66．空间排阻色谱法(StericExclusionChromatography)空间排阻色谱法以凝胶(gel)为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。第四节液相色谱法固定相上节讲了高效液相色谱法的主要类型及其分离原理，本节介绍一下各种类型液相色谱所用的固定相。一、液—液色谱法及离子对色谱法固定相与GLC类似，LLC的固定相也是在担体上涂渍一层固定液构成，或使用化学键合相。1．担体龙岩学院分析化学精品课程电子课件7所用的担体可分为如下几类：(1)全多孔型担体：a.HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的Φ100μm全多孔型担体。其缺点是：填料的不规则性和较宽的粒度范围会导致填充不易均匀，柱效低；填料孔径分布不一，并存在“裂隙”在填料深孔中形成滞留液体（液坑），溶质分子在深孔中扩散和传质慢，使色谱峰变宽，柱效下降。b.HPLC在20世纪70年代初开始使用Φ〈10μm全多孔型担体，它是由nm级的硅胶微粒堆积而成Φ为5μm或稍大的全多孔小球。其优点是：颗粒小而均匀，传质快（距离短），柱效高。(2)表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）：它是直径为30～40μm的实心核(玻璃微珠)，表层上附有一层厚度约为1～2μm多孔表面(多孔硅胶)。其优点是：孔穴浅（固定相仅为表面的一薄层），传质速度快，易于填充均匀，柱效高。其缺点是：柱子容量低、需要配用高灵敏检测器。这种担体目前应用较为普遍。2．固定液液—液色谱流动相和固定相都是液体，因此要求两相要互不相溶。在液-液色谱中常用的固定也只有极性不同的几种，如β，β'-氧二丙腈、聚已二醇-400和角鲨烷等。3．化学键合固定相：将固定液机械的涂在担体表面上构成的这种固定相，在实际使用时存在不少缺点，20世纪60年末发展起来了一种新型的固定相---化学键合固定相。即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担体表面。根据在硅胶表面(具有≡Si－OH基团)的化学反应不同，键合固定相可分为：硅氧碳键型龙岩学院分析化学精品课程电子课件8(≡Si－O－C)；硅氧硅碳键型(≡Si－O－Si－C)硅碳键型（≡Si－C）和硅氮键型（≡Si－N）四种类型。化学键