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第九章维生素类药物的分析•维生素是维持人类机体正常代谢功能所必需的一类活性物质，主要用于机体的能量转移和代谢调节，体内不能自行合成，须从事物中摄取。这类药物的分析方法很多，有生物法、微生物法、化学法和物理化学法，但目前常用的分析方法是化学法或物理化学法。第一节维生素A的分析•维生素A包括有a.维生素A1（视黄醇）活性最强不饱和脂肪醇主要来源于鲛类无毒海鱼肝脏中提取的脂肪油。在鱼肝油中维生素A多以各种酯类混合物的形式存在，其中主要为醋酸酯和棕榈酸酯。b.维生素A2（去H维生素）30%-40%c.维生素A3（去水维生素）0.4%一结构和性质（一）结构•维生素A的结构为具有一个共轭多烯醇侧链的环己烯，具有许多立体异构体。维生素A多为全反式。不同的异构体具有相似的化学性质，但具有不同的光谱特性和生物效价。（二）性质•1.溶解性由于是有机物，所以具有脂溶性，溶于乙醚、石油醚等有机溶剂中，在乙醇中微溶，在水中不溶。•2.不稳定性由于有多个不饱和键，所以性质不稳定，易被空气中氧或氧化剂氧化，易被紫外光所裂解，特别是在加热和金属离子存在是，更易氧化变质，生成无生物活性的环氧化合物维生素醛或维生素酸。维生素A对酸不稳定，遇Lewwis或无水氯化氢乙醇液，可发生脱水反应。其中V.A的醋酸酯比V.A稳定。由于不稳定性，所以应保存在凉暗处，并需充氮气或加入合适的抗氧剂。•3。紫外吸收特性在325-328处有最大吸收，可用于鉴别和含量测定•4.与三氯化锑呈色V.A在氯仿溶液中能与三氯化锑作用，产生不稳定的蓝色。可用于鉴别或用比色法测定含量二.鉴别实验（一）三氯化锑反应1.原理V.A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中即显蓝色，渐变成紫红色。2.机制：V.A和氯化锑（三价）中存在的亲电试剂氯化高锑（五价）作用形成不稳定的蓝色碳正离子。3.方法见书P2074.注意事项无水无醇条件下进行及其原因：水可使三氯化锑水解成氯化氧锑，而乙醇可以和正离子作用使其正电荷消失。所以仪器和试剂必需干燥无水，氯仿中应无醇。（二）紫外吸收光谱法1.方法配制溶液，并立即用紫外分光光度计在300-400nm的波长范围内进行扫描，则应在348、367、389nm的波长处有三个尖锐的吸收峰，且在332的波长处有较低的吸收峰或拐点。2.讨论最大吸收波长与共轭程度有关：共轭程度越大，其波长也就越大。具体情况见P208（三）薄层色谱法•第一种：BP（2000）•吸附剂：硅胶G•流动相：环几烷-乙醚（80：20）•显色剂：三氯化锑•第二种：USP（24）•硅胶•环几烷-乙醚（80：20）•磷镭酸三.含量测定先用紫外分光光度法代替反应专属性差、呈色不稳定的三氯化锑比色法。但由于三氯化锑比色法操作简便、快速，所以目前仍旧是食品或饲料中V.A含量测定的常用方法。（一）紫外分光光度法（三点校正法）1.三点校正法的建立V.A在325nm-328nm的波长范围内具有最大吸收，可用于含量的测定。但其中有很多杂质在紫外区也有吸收，而干扰V.A的准确的含量测定。其中有其多种异构体、氧化降解产物、合成中间体和副产物等。采用“三点校正法”能够消除这些杂质的无关吸收的干扰。什么是“三点校正法”？三点校正法是指在三个波长处测得吸收度后，在规定的条件下以校正公式进行校正，再进行计算。这样就可以消除无关吸收的干扰。注：V.A在325nm-328nm的波长范围内有最大吸收，其最大吸收波长随溶剂的不同而有所不同。具体数据见P209表9-3。2.测定原理两点原理：•（1）.杂质的无关吸收在310nm-340nm的波长范围内几乎成一条直线，且随波长的增大吸收度下降。•（2）.物质对吸收呈加和性的原理。3.波长的选择选择原则：一点选择在维生素A的最大吸收波长处，其他两点选择在的两侧各选一点（•第一法（等波长差法）•第二法（等吸收比法）4.杂质的吸收•对V.A有影响的杂质主要有以下几种：•(1)V.A2和V.A3•(2)维生素A的氧化产物•(3)维生素A在光照下产生的无活性的聚合物•(4)维生素A的异构体等。以上这些杂质在310nm-340nm的波长范围内有吸收，干扰维生素A的测定。5.测定方法（1）第一法（直接测定法，适用于纯度高的维生素A醋酸酯）•1）方法见书上P210•2）计算a.吸光系数E1%1cmb.求效价（IU/g）：c.求维生素A醋酸酯占标示量的百分含量•3）换算因子：•4）A值的选择：a.计算吸收度比值：与中国药典的吸收度比值相比较，判断每个差值的绝对值是否超过0.02。b.判断法最大吸收波长在326-329nm之间，且5个波长下的绝对值差值均不超过0.02时，可直接用328nm波长处的测得的吸收度值求得吸收系数。最大吸收波长不在326-329nm之间，计算5个波长下的绝对差值，如果有一个或几个超过0.02，这是应按以下的方法进行判断：若（A328校正-A328）*100%/A328所得的数值的绝对值在3.0%，则仍不用校正公式计算吸收度。可直接用A328代入E=A/C.L若（A328校正-A328）*100%/A328所得的数值的绝对值在-15.0%到-3.0%，则应用A328校正代入E=A/C.L若（A328校正-A328）*100%/A328所得的数值的绝对值在小于-15%或大于+3%，则不能用本法测定，应使用第二法。如果最大吸收波长不在326-329nm之间，也不能用本法测定。第一法的校正公式为：A328校正=3.52（2A328–A316-A340）（2）第二法（皂化法，适用于维生素A醇）•1）方法精密称取一定量的供试品，加KOH乙醇溶液后煮沸回流，得到的皂化液再经过提取、洗涤、滤过、浓缩和干燥等处理，最后用异丙醇溶解残渣并稀释成每1ml中含维生素A为9-15个国际单位数的溶液，在300、310、325、334nm波长处测定吸收度，并确定最大吸收波长（应为325nm）。•2）计算同第一法。看书上p210-2113）A值的选择如果最大吸收波长在323-327nm之间，且A300/A325比值=0.73，按下法判断：a.若（A325校正-A325）*100%/A325所得的数值的绝对值在3%，可直接用A325代入E=A/C.Lb.若（A325校正-A325）*100%/A325所得的数值的绝对值超过3%，则用应用A325校正代入E=A/C.L如果最大吸收波长不在323-327nm之间，或A300/A325比值0.73，表示供试品中杂质含量太高，应采用色谱法将未皂化部分纯化精辟再进行测定。第二法的校正公式：A325校正=6.815A325–2.555A310-4.260A3346.讨论1）.吸收度校正方法：维生素A醋酸酯：直线方程法（代数法）维生素A醇：相似三角形法（几何法或6/7定位法）2）.在应用三点校正法时，除其中一点是在最大吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰的两侧进行测定。如果仪器波长精度不准确时，会产生较大误差。因此，在测定之前务必要校正波长，并可用全反式维生素A进行测定，比较测定结果和比值是否与对照品相符合，以进一步核对波长是否准确。测定的样品不得少于两份。7.应用示例维生素A胶丸、维生素AD胶丸和维生素AD滴剂等均可采用本法测定。（二）三氯化锑比色法•1.原理维生素A与三氯化锑的无水氯仿溶液作用，产生不稳定的蓝色，在618nm-620nm的波长处有最大吸收，符合Beer定律。•2.方法配置溶液，加入一定量的三氯化锑氯仿溶液以后，在5-10s内，于620nm处测定吸收度，绘制标准曲线。按同法测定供试品溶液的吸收度，根据标准曲线计算含量。•3.注意事项•（1）要求操作迅速•（2）反应介质应无水•（3）温度对呈色强度的影响很大，样品滴定时的温度应绘制标准曲线时的温度相差的绝对值应在1摄式度以内。否则应重绘标准曲线。•（4）反应并非维生素A专属，在相同情况下，某些物质也会与三氯化锑反应生成显蓝色，常使测定的结果偏高。•（5）三氯化锑具有腐蚀性，所以使用时应该当心。（三）高效液相色谱法•采用RP-HPLC法同时测定人血清中维生素A和维生素E的含量。•1.仪器：•2.分析用样品液：1)对照品：维生素A、维生素E、维生素A醋酸酯2)血清样品制备：采血后立即离心，置5ml塑料试管中，充氮、密封，于-40摄式度保存备用。精密量取血清200微升，精密加入含一定浓度内标溶液的无水乙醇200微升，振荡30s，精密加入正己烷，离心，取正己烷层100微升进样。•3.方法与结果1)线形关系：模拟样品提取液配比、连续进样3次、用峰高比对浓度作图2)维生素A的回归方程：3)维生素E的回归方程：4)检测量：问：检测量与被检测物质及其浓度和进样量有关吗？5)回收率试验：6)精密度试验：用正常人的血清样品进行精密度试验，由回归方程计算实际浓度。•4.讨论1)对吸收特性不同的物质采用不同的波长和灵敏度。2)虽用维生素A醋酸酯做内标测定维生素E的含量，尽管两者的化学性质相差很大，但因其测定波长和灵敏度的不同，结果还是较满意的。3)样品处理方法简便、结果准确，样品经液-液萃取就可以进样，省去了氮气流条件下的蒸发等步骤，缩短了分析时间。4）排除了样品中的干扰物质，方法专属性强。可用停留扫描及吸收度比测定技术对样品中retinol和a-tocopherol与已知对照品进行对照来说明。5）贮藏：在制备和贮藏温度下，保存6个月未发生变化；无水乙醇和工作用乙醇2-10摄式度条件下，可分别稳定2周和1周。其中样品的正己烷提取液比较稳定，可以隔夜后进行分析测定。附：三点校正法公式推导1.公式A328校正=3.52（2A328–A316-A340）推导2.公式A325校正=6.815A325–2.555A310-4.260A334推导Thankyou