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菊花的组织培养（二）主讲：黄冈中学优秀生物教师王小敏回顾上节课：一、植物组织培养的原理；二、植物组织培养的基本过程；三、影响植物组织培养的因素。四、实验操作（一）制备MS固体培养基1、配制各种母液：将各种成分按配方比例配制成的浓缩液。使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。2、配制培养基：应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，并用蒸馏水定容到1000毫升。在菊花组织培养中，可以不添加植物激素，原因是菊花茎段组织培养比较容易。3、灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。（二）外植体消毒冲洗→酒精→无菌水冲洗→氯化汞→无菌水冲洗至少三次之上。（三）接种、培养、移栽和栽培1、前期准备：用70%的酒精消毒工作台，点燃酒精灯。注意所有接种工作都必须在酒精灯旁进行，器械使用前后都要用火焰灼烧灭菌。2、接种操作：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种7～8个外植体。3、培养过程应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度和光照。4、移栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。思考：1、高等植物是光能自养型生物，为什么在植物组织培养过程中还需要提供有机物培养基？此时的组织或细胞是离体的，不能体现其整个植物体的光能自养，细胞所生活的环境必需是液体有机物的营养环境。2、培养过程中为什么需要进行光照？该培养过程是一个脱分化、再分化的过程。再分化过程中，愈伤组织分化出芽和根需要光的诱导；随着芽和根的形成，幼苗就具有了光合作用的能力，幼苗的生长和发育需要光照。3、在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？①培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）②外植体的消毒（酒精、氯化汞）③接种的无菌操作（酒精、酒精灯——灼烧）④无菌箱中的培养；⑤移栽到消过毒的环境中生存一段时间。五、结果分析与评价（一）对接种操作中污染情况的分析；（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化；（三）是否进行了统计、对照与记录；（四）生根苗的移栽是否合格。实例：下面植物组织培养过程示意图中还有什么地方不够完善的？答案：没有进行灭菌处理，试管也没有做密封等。1、污染的原因污染：指在组织培养过程中，培养容器内滋生菌斑，使培养材料不能正常生长发育，从而导致培养失败的现象。①细菌污染：菌斑呈粘液状，界限比较明显，一般接种后1～2天即能发现。主要是大肠杆菌和链球菌。②真菌污染：菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子。接种后3～10天才能发现。主要是霉菌污染。2、污染的主要途径3、污染的预防措施六、植物组织培养的特点及应用（一）植物组织培养特点1、培养条件可以人为控制。2、生长周期短，繁殖率高。3、能保持亲本的优良性状。除花药离体培养属于有性生殖外，其他都属于无性生殖。4、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。（二）植物组织培养的应用1、快速繁殖、培育无病毒植株运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如一株兰花一年繁殖到400万株。针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。2、制作人工种子，解决某些作物的繁殖问题。3、远缘杂交：利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。4、突变育种：采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。5、转基因植物的培育：基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。6、生物制品：有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物——紫杉醇等，可通过组织培养方式大规模生产。课堂小结：-返回-同步测试一、选择题1、植物组织培养技术的理论基础之一是（）A．植物细胞的完整性B．植物细胞的多样性C．植物细胞的全能性D．植物细胞杂交2、要大量繁殖用植物体细胞杂交方法获得的植物，应该采用哪种繁殖方式（）A．种子繁殖B．分裂生殖C．出芽生殖D．营养生殖3、下列关于愈伤组织的说法中不正确的是（）A．愈伤组织的细胞能够进行细胞分裂B．用叶培养形成的愈伤组织细胞能够进行光合作用C．培养愈伤组织的培养基中应含有有机养料D．人们可以从愈伤组织中提取所需物质4、在一个多细胞生物体内，存在形态、结构和生理功能上具有稳定性差异的细胞，是因为（）A．细胞失去全能性B．不同的细胞，基因是不同的C．不同细胞中基因选择性表达的结果D．变异一般是不定向的5、细胞具有全能性的原因是（）A．生物体细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能B．生物体的每一个细胞都具有全能性C．生物体的每一个细胞都含有个体发育的全部基因D．生物体的每一个细胞都是由受精卵发育来的6、植物组织培养过程中的脱分化是指（）A．植物体的分生组织通过细胞分裂产生新细胞B．未成熟的种子经过处理培育出幼苗的过程C．植物的器官、组织或细胞，通过离体培养产生愈伤组织的过程D．取植物的枝芽培育成一株新植物的过程7、下列植物细胞全能性最高的是（）A．形成层细胞B．韧皮部细胞C．木质部细胞D．叶肉细胞8、植物组织培养是指（）A．离体的植物器官或细胞培育成愈伤组织B．愈伤组织培育成植株C．离体的植物器官、组织或细胞培养成完整植物体D．愈伤组织形成高度液泡化组织9、某园艺场经过长期精心选育，培养出一株形态优美的兰花，如果要保持母本的优良性状，并尽快大规模繁殖，最适合的繁殖方式是（）A．分裂生殖B．有性生殖C．孢子生殖D．组织培养10、胡萝卜的韧皮部细胞通过组织培养，能发育成新的植株。下列有关的叙述中，不正确的是（）A．说明高度分化的植物细胞具有全能性B．植物细胞的全能性得以表达要离开母体C．新植株的形成是细胞分裂和分化的结果D．高度分化的动物细胞也具有全能性CDBCCCACDD二、非选择题11、基因型为AaBb的水稻（含24条染色体）的花药通过无菌操作接入试管后，在一定条件下形成试管苗，问：（1）愈伤组织是花粉细胞不断分裂后形成的不规则的细胞团，愈伤组织形成过程中，必须从培养基中获得_____________等营养物质。（2）要促进花粉细胞分裂生长，培养基中应有_____________和_____________两类激素。（3）愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，再由芽发育成叶和茎。这一过程必须给予光照，其原因是_____________能利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。（4）试管苗的细胞核中含_________条脱氧核糖核苷酸链。（5）培育成的试管苗可能出现的基因型有_____________。显示答案11、（1）水、无机盐、维生素和小分子有机物（2）细胞分裂素植物生长素（3）叶绿体（4）24（5）AB、aB、Ab、ab12、回答下列有关植物组织培养的问题。（1）用于植物组织培养的植物材料称为________。（2）组织培养中的细胞，从分化状态转变为未分化状态的过程称为________。（3）在再分化阶段所用的培养基中，含有植物激素X和植物激素Y，逐渐改变培养基中这两种植物激素的浓度比，未分化细胞群的变化情况如下图所示，据图指出两种激素的不同浓度比与形成芽、根、愈伤组织的关系：1）当植物激素X与植物激素Y的浓度比等于1时，______________________________；2）________________________________________________________；3）________________________________________________________；（4）若植物激素Y是生长素，在植物组织培养中其主要作用是________；则植物激素X的名称是________________。（5）生产上用试管苗保留植物的优良性状，其原因是________________。显示答案12、（1）外植体（2）去分化（脱分化）（3）1）未分化细胞群经分裂形成愈伤组织；2）当植物激素X与植物激素Y的浓度比大于1时，未分化细胞群分化形成芽；3）当植物激素X与植物激素Y的浓度比小于1时，未分化细胞群分化形成根。（4）促进细胞的生长（伸长）、分裂和分化细胞分裂素（5）组织培养形成试管苗的过程属于无性生殖，后代不发生性状分离。解析：本题主要考查植物组织培养相关知识。（1）植物组织培养的材料叫外植体；（2）植物组织培养的核心过程是脱分化与再分化，脱分化指由分化状态变为未分化状态，再分化指由未分化状态变为分化状态；（3）仔细分析所给示意图，可知植物激素X与植物激素Y浓度比为1时，利于愈伤组织的形成，大于1时利于细胞群分化出芽，小于1时利于细胞群分化出根；（4）生长素在植物组织培养中主要作用是促进细胞生长、分裂和分化，植物组织培养过程中除需要生长素外还必需细胞分裂素，二者共同起作用；（5）植物组织培养是一种无性繁殖技术，利于保持亲本的优良性状。-END-课外拓展兰花的组织培养法国人莫瑞尔（G.M.Morel）首先将组织培养的技术应用在兰花上，采取茎顶组织进行培养，经由类原球体而获得植株。利用组织培养进行芽体增殖是另一个获取种苗的方法，例如，蝴蝶兰便利用花梗芽进行繁殖，这种方法的缺点是繁殖的效率较差，而且成本较高。由于芽体是经由多细胞发育而成，并不适合做为基因转殖的材料。以单细胞做为基因转殖的起始点是最好的方式，而且可以避免得到嵌镶体。不过，目前以细胞来复制兰花还只局限于几个种类，如文心兰、素心兰及蝴蝶兰等，无法广泛使用。以细胞复制兰花以细胞复制文心兰为例，可以采取花梗、根、茎及叶做为培植体，将这些培植体置于合适的人工培养基，一至两个月后，愈伤组织从根尖、茎及叶培植体的切口部位长出。这些诱导出来的愈伤组织可以不断地继代培养于相同的培养基，形成更多的愈伤组织，而且数年之内仍具有再生植株的能力。如此一来，我们便可以维持复制文心兰的系统，不需要每次都从培植体去诱导新的愈伤组织。获得大量愈伤组织后，便要进行体胚诱导的工作。一般而言，诱导体胚所需要的培养基配方会不同于继代培养时所用的。将愈伤组织转移至诱导体胚的培养基，大约一个月后，可以观察体胚的形成。理论上，每个细胞都可以产生一个体胚，所以一小块愈伤组织便可以诱导出数十甚至数百个体胚。接下来的工作便是将这些体胚培育成为完整的小植株，通常需将体胚转移至另一不同配方的培养基。体胚逐渐发育形成原球体。这些自体细胞而来的原球体和种子发育而来的原球体，在形态及发育能力上并没有明显的差异，两者皆可以发育成为正常的植物。只是同一来源的体细胞所形成的原球体具有相同的遗传组成，而种子来源的原球体则皆具有不同的遗传组成。数个月后，原球体发育成为具有地下部及地上部的小植株，待小植株成长至一定大小后，便可以进行驯化的工作。将小植株移出瓶外，种植于栽培容器并移至具有遮阴及喷雾设施的温室进行驯化，可以得到将近百分之百的存活率。除了以细胞复制文心兰之外，素心兰、蝴蝶兰及拖鞋兰等都可以经由愈伤组织诱导出小植株，这些小植株也都能正常的生长。素心兰的愈伤组织是从根茎等营养器官诱导而来的，愈伤组织在继代的过程中形成体胚，这些体胚并不形成原球体而是发育成为根茎，然后才形成小植株。虽然蝴蝶兰及拖鞋兰都可以利用愈伤组织来繁殖，但未来仍需进一步以营养器官或组织来诱导愈伤组织，才能针对特定的优良品种进行繁殖。-END-高考解析例、（北京）以下不能说明细胞全能性的实验是（）A．胡萝卜韧皮部细胞培育出植株B．紫色糯性玉米种子培育出植株C．转入抗虫基因的棉花细胞培育出植株D．番茄与马铃薯体细胞杂交后培育出植株解析：植物细胞全能性是指已高度分化的细胞仍具有发育成完整个体的潜能。应用植物细胞的全能性可以进行植物的组织培养，如胡萝卜韧皮部细胞培育出植株；还可以进行植物体细胞杂交，如番茄与马铃薯体细胞杂交后培育出植株；另外，在转基因作物的培育中，可以将目的基因DNA微管注射到受体细胞，再利用植物细胞全能性培育出植株，虽然这个操作以基因重组的理论为基础，但也应用了植物细胞全能性的理论。而B是由种子发育为个体，属于有性生